直腸癌及癌前病變患者外周血髓源抑制細胞的表達及其臨床意義△

張勇超，李潛，謝建國，王家祥，韓廣森，張永磊，張金岱

鄭州大學附屬腫瘤醫院1普外科，2超聲科，鄭州 450008

3鄭州大學第一附屬醫院小兒外科，鄭州 450052

直腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，大多數直腸癌是由腺瘤惡變而來，目前人們已廣泛認同“腺瘤—腺癌”的演變過程。近年研究發現，髓源抑制細胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤組織中聚集，抑制機體的腫瘤免疫，在腫瘤的免疫逃逸機制中發揮重要作用[1-4]。至今為止，國內外尚缺乏直腸癌及癌前病變患者MDSC的研究報道，本研究以健康體檢者、直腸增生型息肉、直腸絨毛狀腺瘤及直腸癌患者的外周血為樣本，通過流式細胞技術檢測MDSC、T淋巴細胞亞群以及調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）的比例，探討MDSC促進“直腸腺瘤—直腸腺癌”演變的免疫機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

采用隨機抽樣法，收集鄭州大學附屬腫瘤醫院普外科2015年11月至2016年8月收治的155例直腸疾病患者的外周血標本。根據患者腸鏡及病理學檢查結果分為3組：直腸增生型息肉組45例，直腸絨毛狀腺瘤組52例，直腸癌組58例。所有患者均有明確的病理診斷，均為首次診斷且未行化療、放療、手術、靶向治療等抗腫瘤治療，既往均無感染性疾病、免疫系統疾病病史。同時，收集鄭州大學附屬腫瘤醫院40例健康體檢者的外周血標本，作為健康對照組。

1.2 主要試劑

淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司。紅細胞裂解液、藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）標記的鼠抗人CD3單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的鼠抗人CD4單克隆抗體、藻紅蛋白-羰花青-5（P-phycoerythrin-Carbocyanine-5，PE-CY-5）標記的鼠抗人CD8單克隆抗體、PE-CY-7標記的鼠抗人CD11b單克隆抗體、PE-CY-5標記的鼠抗人CD33單克隆抗體、PE-CY-5標記的鼠抗人HLA-DR單克隆抗體、人Treg染色試劑盒及IgG同型對照抗體均購自美國BD公司。流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 流式細胞術檢測

經腸鏡及病理學檢查后，患者于清晨空腹抽取靜脈血3 ml，肝素抗凝，用于流式細胞術檢測。

Treg檢測：取靜脈血2 ml，以淋巴細胞分離液收集單核細胞，然后取細胞懸液100 μl（細胞數約為1×106個），依據Treg染色試劑盒說明書的指導步驟進行操作，透化緩沖液洗滌后，以適量流式染色緩沖液重懸染色細胞，行流式細胞術檢測。

CD4+、CD8+T淋巴細胞檢測：取100 μl靜脈血置于流式管中，加入熒光標記抗體CD3-PE、CD4-FITC、CD8-PE-CY-5各2 μl，2～8 ℃孵育30～60 min。加入紅細胞裂解液2 ml，避光室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后，以適量流式染色緩沖液重懸染色細胞，行流式細胞術檢測。

MDSC檢測：取100 μl靜脈血置于流式管中，加入熒光標記抗體HLA-DR-PE-CY-5、CD33-PE-CY-5、CD11b-PE-CY-7各2 μl，2～8 ℃孵育30～60 min。加入紅細胞裂解液2 ml，避光室溫孵育10 min，PBS洗滌后，以適量流式染色緩沖液重懸染色細胞，行流式細胞術檢測。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及Post-hoc檢驗（SNK法），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關分析采用Pearson檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDSC及Treg比例的比較

4組患者MDSC及Treg比例比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05）；直腸癌組MDSC及Treg比例最高，直腸絨毛狀腺瘤組、直腸增生型息肉組及健康對照組依次下降，進一步兩兩比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 4組研究對象外周血MDSC、Treg比例的比較（%，±s）

表1 4組研究對象外周血MDSC、Treg比例的比較（%，±s）

注：a與直腸癌組比較，P＜0.05；b與直腸絨毛狀腺瘤組比較，P＜0.05；c與直腸增生型息肉組比較，P＜0.05

MDSC比例Treg比例組別

2.2 不同性別、年齡研究對象MDSC比例的比較

不同性別、年齡患者MDSC比例的比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）。（表2）

表2 不同性別、年齡研究對象的MDSC比例（%，±s）

表2 不同性別、年齡研究對象的MDSC比例（%，±s）

特征性別男女4.13±0.92 4.38±1.15 2.68±0.33 2.79±0.45 1.41±0.12 1.62±0.25 0.86±0.15 0.67±0.08年齡（歲）≤60＞60 4.41±1.22 4.09±0.81 2.54±0.28 2.85±0.56 1.59±0.21 1.48±0.17 0.82±0.13 0.73±0.11直腸癌組（n=58）直腸絨毛狀腺瘤組（n=52）直腸增生型息肉組（n=45）健康對照組（n=40）

2.3 T淋巴細胞亞群比例的比較

4組患者CD4+T淋巴細胞比例、CD8+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。進一步兩兩比較，直腸癌組CD8+T淋巴細胞比例最高，直腸絨毛狀腺瘤組、直腸增生型息肉組及健康對照組依次下降；直腸癌組CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值最低，直腸絨毛狀腺瘤組、直腸增生型息肉組及健康對照組依次升高，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表3）

2.4 外周血MDSC比例與Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值的關系

Pearson相關分析結果提示，外周血MDSC比例與Treg比例呈正相關（r=0.887，P﹤0.05），而與CD4+/CD8+T淋巴細胞比值呈負相關（r=-0.793，P﹤0.05）。

表3 4組研究對象T淋巴細胞亞群比例的比較（±s）

表3 4組研究對象T淋巴細胞亞群比例的比較（±s）

注：a與直腸癌組比較，P＜0.05；b與直腸絨毛狀腺瘤組比較，P＜0.05；c與直腸增生型息肉組比較，P＜0.05

組別CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+

3 討論

MDSC是由粒細胞、單核/巨噬細胞和處于早期分化階段的髓系前體細胞組成的異質性并具有分化潛能的細胞群。這些未成熟的髓細胞，可以通過多種途徑抑制機體的獲得性和天然抗腫瘤免疫，使腫瘤細胞逃避機體的免疫監視和攻擊，促進腫瘤進展。在腫瘤源性因子的誘導下，骨髓中的這些未成熟的前體細胞可遷移至肝臟、淋巴器官及外周血，并大量擴增、分化、成熟，抑制機體的腫瘤免疫[5]。至今為止尚未確定人類MDSC的分子標志，在不同組織來源或同一組織來源、不同部位的腫瘤患者中，MDSC可能不盡相同。HLA-DR-CD33+CD11b+是當前研究中報道較多的譜系標志[6]。MDSC介導免疫抑制的機制可能為通過產生精氨酸酶和誘導型一氧化氮合成酶，產生大量的活性氧以及分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等[1]。

近年來，人們發現了一類具有免疫抑制功能的T淋巴細胞，將其命名為Treg，可抑制自身反應性T淋巴細胞的活化，進而抑制其免疫效應，維持自身免疫耐受的狀態。Treg數量和功能的異常與機體的腫瘤免疫密切相關。腫瘤患者腫瘤組織以及外周血中Treg比例增加與腫瘤患者免疫功能低下有關。Treg比例增加時，其免疫抑制功能增強，使機體處于一種高度免疫耐受的狀態，從而為腫瘤的發生、發展提供了免疫逃逸的環境。已有研究發現，腫瘤患者中Treg細胞數量和比例增多[7]，提示機體正處于潛在的免疫抑制狀態。外周血中成熟的T淋巴細胞是機體免疫系統中功能最重要的細胞群，可分為CD4+和CD8+兩個亞群，在維持機體正常的免疫功能中發揮重要作用。研究表明，T淋巴細胞亞群的變化與腫瘤的發生、發展有密切關系[8]。腫瘤患者的T淋巴細胞亞群發生明顯變化，即CD4+T淋巴細胞減少，而CD8+T淋巴細胞增加，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值下降；且隨著腫瘤的進展，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值進一步下降，并可能出現倒置。

直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，早期發現是提高治愈率和生存率的關鍵。積極發現和治療癌前病變，可阻斷癌變進程，預防直腸癌的發生。許多研究表明，大多數直腸癌是由腺瘤惡變而來的，即腺瘤—腺癌演變過程。目前已公認直腸腺瘤是一種癌前病變，且認為腺瘤癌變與腺瘤類型、瘤體大小和組織學類型有關。國內外尚未有直腸癌及癌前病變患者MDSC的研究報道，本研究首次就這一領域進行探討。本研究結果顯示，與健康體檢者相比，直腸增生型息肉、直腸絨毛狀腺瘤、直腸癌患者外周血中MDSC比例均明顯增加；MDSC比例與性別、年齡無關；與健康體檢者相比，直腸增生性息肉、直腸絨毛狀腺瘤、直腸癌患者外周血中的Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值亦有明顯變化，且Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值的變化與MDSC比例的變化具有相關性。結果提示，在直腸腺瘤—直腸腺癌的發生演變過程中，MDSC可能通過誘導Treg產生及CD4+、CD8+T淋巴細胞比例變化來抑制機體的細胞免疫功能，進而引起腫瘤的免疫逃逸，促進腫瘤的發生發展。

綜上所述，本研究提示MDSC可能通過調控Treg及CD4+/CD8+T淋巴細胞比例來抑制機體的細胞免疫功能，誘導腫瘤免疫逃逸，最終導致“直腸腺瘤—直腸腺癌”的演變過程。因此，在直腸癌的防治及綜合治療時，可以考慮聯合靶向MDSC療法[9-10]，以提高治療效果，改善患者的預后。

參考文獻

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