蝦肝腸胞蟲（EHP）在凡納濱對蝦養殖水環境中的分布情況及傳播途徑初步研究

丁慧昕，施 慧，謝建軍，王庚申，汪 瑋，何 杰，許文軍

（1.浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022）

蝦肝腸胞蟲Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）歸屬于孢子蟲綱Sporozoa，隱孢子蟲目Cryptosporidium，腸上皮微孢子蟲科，是目前凡納濱對蝦養殖過程中出現的一種重要寄生蟲病原，主要寄生于對蝦肝胰腺小管的上皮細胞內，已被證實與對蝦生長緩慢癥關系密切。其最早發現于泰國養殖的生長緩慢的斑節對蝦，感染該寄生蟲的對蝦往往吃料正常，不會發生爆發性死亡，但生長緩慢或停滯，并出現大小不一的情況[1]。自2013年以來，我國所有的凡納濱對蝦養殖主產區均已發現了蝦肝腸胞蟲病[2]，并造成重大危害，嚴重影響對蝦養殖業的健康與持續發展。

EHP的個體微小，大小為（1.1±0.2）～（0.7±0.1）μm，臨床上普通的光學顯微鏡很難觀察或診斷，主要依靠實驗室檢測才可確診。關于EHP的檢測方法的研究報道較多，SANTHOSHKUMAR，et al[3]運用組織病理學方法觀察到了在人工感染試驗對蝦體內處于不同發育階段的EHP；TANGPRASITTIPAP，et al[4]建立了套式PCR檢測法和地高辛標記核酸探針原位雜交法；劉珍等[2]將實時熒光定量PCR法運用于EHP的實驗室檢測；SUEBSING，et al[5]建立EHP的LAMP技術方法，使臨床檢測EHP更簡單、快速；但目前尚無有關EHP在養殖水環境中分布情況的報道。為了了解EHP在水環境中分布情況以及傳播途徑，本研究采用巢式PCR檢測方法，對舟山地區凡納濱對蝦養殖水環境中采集的其它水生生物以及水樣等樣本進行EHP檢測，初步分析了EHP在對蝦養殖水體環境中的分布情況；同時以不同方式保存的病蝦對健康對蝦進行了人工感染試驗，分析了EHP在養殖水環境中的傳播方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

水樣分別為出現生長緩慢的對蝦養殖場進水、養殖塘水、養殖塘排水渠中尾水，生物樣本主要為養殖場排水渠中魚、蝦類和蟹類。EHP感染蝦采集自浙江省海洋水產研究所試驗場；人工感染試驗所用的健康凡納濱對蝦取自舟山市旭旺養殖場，體長為7.5±0.5 cm。

1.1.2 試劑

組織DNA提取試劑盒QlAampDNA Mini Kit購自Qiagen公司；高保真Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 2000 Marker、UNIQ-10柱式膠回收試劑盒購買自TAKARA公司；其它均為國產分析純級試劑。

1.2 儀器和設備

實驗使用的主要儀器：AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Centrifuge 5424R臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Nikon Eclipse 50i生物顯微鏡，美國尼康公司；Bio-Rad DNA Engine多槽PCR儀和Bio-Rad GDXI型凝膠成像系統，美國伯樂公司；漩渦振蕩器，德國IKA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 養殖水環境樣本的采集

于2017年4月至2017年10月，分3批次采集，共4個種類的108個樣；其中，魚類共采集了鯔魚7尾，彈涂魚10尾；蟹類共采集寄居蟹11只，招潮蟹12只；蝦類采集綠籽蝦26尾，口蝦蛄1尾。將樣本冰鮮保存帶回實驗室，每種采樣信息和分析樣本數量見表1。

表1 養殖環境中生物采樣信息Tab.1 Biological sampling information in aquaculture environment

1.3.2 人工感染試驗方法

采用巢式PCR檢測健康蝦體內EHP攜帶情況，經PCR確認EHP核酸陰性后，暫養1周備用；感染用病蝦運用巢式PCR檢測EHP，確認EHP核酸陽性后，一部分病蝦-20℃凍存，一部分暫養備用。

從采集的健康凡納濱對蝦中挑選大小均一、體格健壯的對蝦用于感染實驗，試驗期間連續充氣，水溫為24～26℃。感染實驗共設A、B、C、D四組，每組均設立平行對照，A組投喂冰凍病蝦的肝胰腺組織，B組投喂鮮活病蝦的肝胰腺組織，C組為健康蝦與病蝦混合飼養，D組為對照組，每組24尾蝦。試驗期間前2周，A組和B組只投喂病蝦的肝胰腺組織，C組和D組投喂正常人工配合飼料，每日早晚投喂1次。實驗期間每天清理試驗對蝦的殘餌和排泄物，隔天換水1次。連續投喂兩周以后，全部投喂正常人工配合飼料，1周之后隨機取樣，每組3尾，每周取樣1次，共采集4周。

1.3.3 PCR模板制備

水樣本使用0.22 μm濾膜進行抽濾，濾膜用適量生理鹽水沖洗，洗液離心后棄上清，取沉淀提取DNA樣本；采集的魚樣本取腸道組織提取DNA樣本；采集的蝦蟹樣本和人工感染試驗組對蝦，取肝胰腺組織提取DNA樣本；上述樣本分別稱取20～25 mg，使用QlAamp DNA Mini Kit，按照說明書提取總基因組DNA。

1.3.4 巢式PCR擴增

樣品檢測主要采用亞太水產養殖中心網絡（NACA）推薦的巢式PCR檢測方法，引物包括一對外引物ExF/ExR 和一對內引物 InF/InR：ExF：5′–TTG ACG TGA AGC AAT TGG AG–3′；ExR：5′–AAG CAG CAC AAT CCA CTC CT–3′；InF：5′–GGT GGG CAA AGA ATG AAA TC–3′；InR：5′–CGA GCG TAC TAT CCC CAG AG–3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR 反應體系（25 μL）為：2.5 μL 10×buffer、2 μL dNTP（2.5 mM）、Primer 1 和 2（10 μM）各 0.25 μL、0.25 μL Taq DNA 聚合酶、5 μL DNA模板，用滅菌去離子水補充反應總體積至25 μL，將混合物置PCR儀中反應。PCR循環參數：94℃預變性5 min后開始循環，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共35個循環，最后72℃延伸7 min。取5 μL PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀中照相記錄。二次PCR模板為一次PCR擴增產物，PCR反應體系及循環參數同一次PCR，獲得的PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

2 結果

2.1 養殖場采集樣品檢測結果

從攜帶EHP對蝦養殖塘中采集的水樣，經PCR檢測，EHP均呈核酸陽性，但養殖塘進水口和排水渠中采集的水樣未有EHP檢出，采集的水生生物樣本中蝦和蟹類的部分樣本PCR檢測EHP呈核酸陽性，采集的魚類樣本未有EHP檢測，具體結果見表2。

表2 養殖環境采集樣品的PCR結果以及陽性檢出率Tab.2 Detection of EHP in samples of aquaculture environment by PCR and positive rates

2.2 樣品檢測基因擴增測序結果

采集樣本的二次PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,在250～500 bp處可見特異性單一條帶。將獲得的PCR擴增產物進行序列測定，應用DNAMAN軟件進行比對分析,獲得一個223 bp大小的基因片段。該序列經BLAST同源檢索分析,與TANGPRASITTIPAP，et al[4]之前報道的感染斑節對蝦Penaeus monodon的EHP的基因序列（KF362130）結果一致。

圖1 養殖場采集蝦、蟹類樣本EHP PCR檢測結果Fig.1 Detected results of the E.hepatopenaei infection of P.vannamei samples by PCR

2.3 人工感染實驗樣品檢測結果

病蝦肝胰腺組織投喂組投喂2周后停止投喂，改為投喂正常飼料，1周后開始取樣，每隔7 d取樣1次進行PCR檢測，前3次每次3尾，最后一次6尾，共計24個樣本，陽性檢出率為12.5%；混合飼養組混養1周后開始取樣，7 d取樣1次，每次3尾，共取樣5次，共計24個樣本，陽性檢出率為54.2%；對照組取樣次數和尾數同混合飼養組，未有EHP檢出，結果見表3。

3 討論

微孢子蟲是一類古老的細胞內寄生微生物，所有微孢子蟲的生活史均起始于成熟孢子在適當環境下擠出極絲，釋放出具有侵染性的孢原質，孢子在被寄主吞入消化道后迅速活化并在寄主體內迅速增殖并繼續侵染[6-7]。TOURTIP，et al[8]研究發現EHP在斑節對蝦的肝胰腺管上皮細胞中發育成成熟的帶有極絲的孢子。本研究分別從攜帶EHP對蝦的養殖水體、蝦塘進水口及排水渠中均采集了水和生物樣本，PCR檢測結果顯示，發病蝦塘中水體中EHP陽性檢出率100%，雖然蝦塘的進水口和排水渠水樣本中未有檢出EHP，但排水渠采集的蝦蟹等甲殼類樣本中檢出了EHP。在人工感染試驗中，與健康蝦和病蝦混合飼養組陽性檢出率54.2%相比，冰凍或活蝦肝胰腺組織投喂組EHP陽性率檢出率相對比較低，分別只有12.5%和45.8%。這可能與孢子蟲的生活史特征也有關聯，由于病蝦體內EHP不可能都處于成熟階段，在養殖試驗過程中，這些未成熟的EHP會繼續發育成熟，從而形成出更多成熟孢子并釋放到養殖環境中，增加了混養的健康蝦接觸這些具有侵染性的孢子的機會，而投喂冰凍或活蝦肝胰腺組織組，投喂的組織中成熟孢子有限，健康蝦攝食到侵染性孢子的機會少，降低了感染機率。試驗結果說明EHP感染對蝦后在蝦肝胰腺管細胞內形成孢原質，成熟后又通過糞便排出體外，在水環境中形成孢子體，散在分布于水體或附著于藻類、碎屑、飼料表面以及池壁和底泥環境中，孢子可在養殖環境中累積，從而導致疫情的傳播。

表3 人工感染樣品的PCR結果以及陽性檢出率Tab.3 Detection of EHP in samples of artificial infection by PCR and positive rates

圖2 凡納濱對蝦樣本EHP PCR檢測結果Fig.2 Detected results of the E.hepatopenaei infection of P.vannamei samples by PCR

本試驗采集了感染EHP養殖塘排水渠中的蝦、蟹及魚類等水生動物樣本進行EHP攜帶情況檢測，結果在蝦和蟹類樣本中檢出了EHP，但采集的所有魚類樣本中并未有EHP檢出。本試驗結果表明對蝦可以通過攝食攜帶EHP的對蝦直接感染EHP，結果與劉珍等[2]試驗結果相同。王維娜等[6]認為感染對蝦的微孢子蟲其中間宿主主要是各種魚類，但本試驗結果表明EHP的增殖并不需要中間宿主，但不排除魚類是EHP傳播過程中宿主的可能性。本研究中對蝦塘進水口和排水渠水樣中沒有檢測出EHP，是因為進水口和排水渠均為相對開放的的一個水環境，且流速一般比較大，附著孢子的浮游生物極易隨流水進入外海，所以進水口和排水渠水樣相對養殖塘比較難檢測到EHP。

微孢子蟲表面包裹著一層致密特殊結構，使得微孢子蟲能抵御外界環境、維持自身形態和滲透壓等方面發揮著重要作用。游信毅等[9]利用10%的甘油、乙二醇、水等作為冷凍保護劑，將東方蜜蜂微孢子蟲的孢子在-80℃保存5個月后對意蜂工蜂進行感染，結果幾種冷凍保存劑保存的孢子都能夠侵染意蜂。本試驗中攝食冷凍保存的病蝦肝胰腺組織健康蝦在一段時間后，部分對蝦肝胰腺EHP檢測呈核酸陽性，但冰凍組總陽性檢出率低于鮮活病蝦肝胰腺組織投喂組，說明低溫環境使部分EHP喪失了侵染性，但仍然有部分EHP可以存活并仍具有感染力，結果與劉珍等[10]的實驗結果吻合。JAROENLAK，et al[10]研究發現輪蟲和鹵蟲可以攜帶EHP，而兩者又是對蝦苗種生產中主要餌料，這將增加對蝦感染EHP的可能性，因此建議在養殖生產中應對投喂的鮮活餌料進行巴氏消毒處理，以預防對蝦感染EHP。劉珍等[11]和陳祿芝等[12]研究認為對蝦EHP的載量與養殖環境有緊密聯系，環境不同其EHP的載量指數不同。目前EHP對養殖對蝦的危害程度還不十分清楚，而感染EHP的對蝦缺乏可供判斷的特征性臨床病征，只有通過PCR等實驗室檢測手段才可以確診，同時由于EHP無有效治療措施，因此在對蝦養殖過程中，對養殖水體、飼養餌料以及養殖尾水等環境因素進行嚴格把關，對控制對蝦感染EHP病原極為重要。

參考文獻：

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