青蒿素聯合厄洛替尼對肺癌細胞生物學行為的影響

趙福成，韓艷茹，賈 奎，劉彩莉，劉振洲

肺癌是全球癌癥相關死亡的最常見原因。每年約有1 800萬人被診斷患有肺癌，約有1 600人死于該疾病[1]。根據其癌癥分級和發病地區的不同，肺癌總體的5年生存率約為4%～17%[2]。肺癌的治療方式主要包括手術、放療、化療、經皮消融和姑息治療等[3]。它是一類異質性極高的惡性腫瘤[4]，根據其組織病理學的差異，目前肺癌的分類分型已超過50種[5]。由于不同類型的肺癌具有不同的遺傳，生物和臨床特征，對不同治療的反應性也不盡相同，所以對肺癌的分類治療是很有必要的，以確保肺癌患者獲得最佳的治療方式[6]。

近年來，為了治療晚期肺癌，學者們已經研發了多種分子靶向療法。例如吉非替尼（Iressa），其靶點為表皮生長因子受體（EGFR）的酪氨酸激酶結構域，它在許多非小細胞肺癌中都有表達[7]。埃羅替尼（Tarceva）是另一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑，2004年被美國食品和藥品管理局（FDA）批準用于晚期非小細胞肺癌的二線治療，與吉非替尼類似，它似乎在女性、亞洲人、非吸煙者和支氣管肺泡癌患者中效果更好，特別是對于EGFR有特異突變的患者[8]。

厄洛替尼也是一種用于治療非小細胞肺癌（NSCLC）的靶向藥物。它是作用于表皮生長因子受體（EGFR）的酪氨酸激酶抑制劑。FDA批準厄洛替尼用于治療局部晚期或轉移性非小細胞肺癌。無論肺癌患者是否有EGFR突變，厄洛替尼均能改善其生存時間，但在EGFR突變患者中效果更好，無進展生存期和5年生存率與標準二線治療（多西他賽或培美曲塞）相似，總體反應率較標準二線化療提高了約50%[9]。與其他ATP競爭性小分子酪氨酸激酶抑制劑（如CML中的伊馬替尼）一樣，使用厄洛替尼的患者在治療開始8～12個月內會迅速發展抗藥性。超過50%的抗藥性是由EGFR激酶區域的ATP結合區的突變引起的，主要是由于非極性甲硫氨酸殘基（T790M）取代極性蘇氨酸殘基所致。雖然“守門人”突變假說的支持者表明這種突變阻止厄洛替尼通過空間位阻的結合，但研究表明T790M賦予ATP結合親和力的增加，從而降低厄洛替尼的抑制功效[10-11]。

青蒿素是從黃花蒿中提取出來的一種晶狀體，青蒿素及其半合成衍生物是治療瘧疾的首選藥物[12]。青蒿素及其衍生物已被證明具有一定的抗腫瘤效應，它能參與細胞一系列的生理生化過程，能抑制腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡，誘導氧化應激和抗血管生成作用[13]。

本研究使用A549細胞株進行青蒿素和厄洛替尼聯合應用，通過檢測A549細胞活力和凋亡情況，以及藥物對小鼠成瘤的影響，探究蒿素聯合厄洛替尼對NSCLC的治療的潛在可能。

1 方法

1.1 細胞系和試劑 人肺癌細胞株A549由上海細胞生物研究所提供。RPMI-1640培養液、10%新生小牛血清、含100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的0．25%胰酶溶液購自Gibco公司，分析純二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司。細胞在含有10%FBS、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的培養基中，37℃環境下在5%CO2培養箱中培養，生長至80%左右濃度時進行傳代和凍存，用于后續的實驗。細胞培養瓶和96孔板購自杭州四季慶生物工程材料有限公司。

1.2 藥物和試劑 青蒿素購自Sigma公司。厄洛替尼購自羅氏公司。將厄洛替尼溶解于DMSO，配置為終濃度為 2．5×104μmol/L 的溶液，分裝保存于-20 ℃冰箱備用，加藥時用PBS溶液（pH7．2）稀釋至目標濃度。CCK-8試劑盒購于日本同仁研究所。Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購于上海美季生物技術有限公司。

1.3 細胞活性的測定 使用CCK-8試劑盒測定細胞的活性。將A549細胞接種在96孔板中，每孔1×104個細胞。在37℃、5%CO2的培養箱中孵育24 h。更換新培養基，將樣品置入處理組和對照組中。處理組中的細胞用 0．5、1、2．5、5、10 或 20 μg/mL 青蒿素和/或厄洛替尼處理24 h。處理后，將96孔板中的培養基用新鮮培養基替換。然后加入20μL的CCK-8溶液，并在37℃下孵育4 h。使用酶標儀板在490 nm波長下測量不同組的OD值。

1.4 細胞凋亡實驗檢測A549細胞的凋亡 流式細胞術FITC-Annexin V/PI雙染色被認為是理想的定量測定細胞凋亡的方法。將A549細胞以2×106的密度接種在6孔板中細胞/孔并生長24h。然后單獨用青蒿素處理（10μg/mL），單獨用厄洛替尼（10μg/mL）或青蒿素（10μg/mL）+厄洛替尼（10μg/mL）處理24h。加入100μL細胞懸液5μL Annexin V-FITC和10μLPI，并將細胞在黑暗中孵育30 min。PI（5μL，濃度為10μg/mL）加入細胞，在黑暗中再次孵育10 min。通過流式細胞術評估細胞以識別細胞周期的變化。細胞增殖指數按照下列公式計算：PI%=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.5 體內動物實驗 通過A549細胞建立小鼠成瘤模型來研究青蒿素和厄洛替尼在體內是否有抑癌的作用。總共選取了35只雄性BALB/c裸鼠（年齡6～8周；體質量約等于25 g），小鼠喂養在25℃和70%相對濕度的環境下，同時給予12 h光照/黑暗循環。所有小鼠的飲水及飼料都經過高溫高壓處理。首先建立小鼠成瘤模型。將含有2×106A549細胞的100μL PBS溶液皮下注射到每只老鼠的背部，每兩天測量一次腫瘤的體積，測量公式如下：腫瘤體積=0．5×長軸×短軸2。同時每兩天測量1次小鼠的質量。當腫瘤體積達到約100 mm3時，將小鼠分為5組（每組7只）進行不同處理，分組如下：1）對照組（無注射）。2）生理鹽水組，每只小鼠用100μL的生理鹽水進行腫瘤內注射。3）青蒿素組，每只小鼠接受15 mg/kg青蒿素的腫瘤內注射。4）厄洛替尼組，每只小鼠接受15 mg/kg厄洛替尼的腫瘤內注射。5）聯合治療組，每只小鼠接受15 mg/kg青蒿素+15 mg/kg厄洛替尼的腫瘤內注射。

1.6 統計分析 統計學處理采用SPSS19．0統計學軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，重復測量資料采取重復測量方差分析，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青蒿素和厄洛替尼對A549細胞活性的影響 CCK-8是常用的檢測細胞活力的方法。如表1所示，隨著青蒿素和厄洛替尼濃度的升高，A549的細胞活性隨之下降。用不同濃度的青蒿素（DHA）單獨處理細胞24 h后，細胞活性在45%～95%之間；用不同濃度的厄洛替尼（DOX）單獨處理細胞24 h后，細胞活性在42%～94%之間。使用青蒿素和厄洛替尼聯合治療后，細胞活力降低達到91%。當10μg/mL青蒿素和10μg/mL厄洛替尼的組合處理細胞時，在細胞活力下降了89%，與5μg/mL青蒿素+5μg/mL 厄洛替尼的組合有統計學差異（P＜0．05），而20μg/mL青蒿素+20μg/mL厄洛替尼的組合無統計學差異（P＞0．05）。因此，將 10μg/mL 青蒿素加10μg/mL厄洛替尼作為最佳的濃度。

2.2 驗證青蒿素和厄洛替尼誘導A549細胞凋亡 為了進一步驗證青蒿素和厄洛替尼所誘導的細胞死亡形式是凋亡，選擇使用流式細胞術檢測的annexin V-FITC/PI雙標記法。如圖1所示，各組的凋亡率分別為 3．1%±1．9%、50．2%±4．6%、41．2%±3．5%、28．7%±5．5%、90．2%±2．5%。在用青蒿素+厄洛替尼對A549細胞處理后，凋亡細胞的百分比從3%（對照）增加到90%（24 h），但壞死細胞的增加并不明顯。陽性對照組（STS）顯示Q2+Q4代表了細胞凋亡。在使用青蒿素或厄洛替尼單獨處理的細胞中，也存在細胞凋亡，但聯合用藥組的凋亡率高于單獨用藥組（P＜0．01）。

2.3 青蒿素和厄洛替尼對小鼠成瘤的影響 本研究對小鼠體內腫瘤注射不同的藥物，通過評估腫瘤體積的改變來評估藥物對腫瘤的治療效果。在接種細胞4～7 d后，腫瘤開始形成，所有小鼠均成功成瘤。腫瘤形成的早期小鼠一般情況無明顯差異，體質量、精神、攝食等未將顯著變化。隨著腫瘤的增大，小鼠的精神和活動逐漸變差，各組間無明顯的差異，整個實驗過程中，小鼠無死亡。聯合治療組在使用青蒿素+厄洛替尼處理小鼠后各時點均對腫瘤有顯著的抑制增長作用，與對照組和生理鹽水組比較差異具有統計學意義（P＜0．01）。見表 2。

2.4 青蒿素和厄洛替尼對小鼠體質量的影響 藥物的體內毒性一直是臨床關注的問題。通過監測給藥后小鼠體質量的變化來判斷藥物的毒性作用。如表3所示，與對照組相比，小鼠的體質量均緩慢上升，無論是單獨用藥還是聯合用藥，均無統計學差異。結果說明藥物對小鼠無明顯毒性作用。

3 討論

圖1 青蒿素和厄洛替尼對細胞凋亡的影響。Fig.1 Effectsof artemisinin and erlotinib on cell apoptosis.

表1 .不同濃度的青蒿素和厄洛替尼對A549細胞活性的影響（x±s）Tab.1 Effect on the viability of the A549 cellsafter 24 h of treatment with Artemisinin and Erlotinib at different concentrations（x±s）

表2 青蒿素和厄洛替尼聯合用藥對小鼠成瘤的影響（x±s）Tab.2 Effect of artemisinin and erlotinib on tumorigenesis in mice（x±s）

表3 青蒿素和厄洛替尼聯合用藥對小鼠體質量的影響（x±s）Tab.3 Effect of artemisinin and erlotinib on body weight in mice（x±s）

青蒿素及其衍生物，作為一種從中草藥中提取的物質，在具有強大抗瘧功效的同時也被證實有一定的改善免疫系統的作用和抗腫瘤作用[14-16]。抗腫瘤作用包括增強藥物的選擇性，扭轉多重耐藥性，對放化療的增敏作用等。許多的青蒿素衍生物都被合成用來治療多種腫瘤，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤、肺癌、胃癌、肝細胞肝癌、胰腺癌、腎癌、骨肉瘤、膠質細胞瘤和白血病。這些衍生物的作用在體內外實驗中得到了相應證實[17]。Park等發現青蒿素對乳腺癌細胞有一定細胞毒性作用，但卻不殺傷正常的乳腺細胞[18]。最初的研究者認為青蒿素產生抗腫瘤作用主要是因為產生了活性氧類（ROS）。隨著研究的深入，學者們發現還存在著其他與活性氧類無直接聯系的抗腫瘤機制，例如它能誘導凋亡與自噬，使細胞周期停滯和細胞增殖的減少，改變的腫瘤相關基因表達，抑制腫瘤血管生成等[13]。

酪氨酸激酶受體（RTKs）在肺癌中起到關鍵的作用。通過使用小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）吉非替尼和厄洛替尼，治療晚期非小細胞肺癌（NSCLC）。厄洛替尼特異性針對表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶，這種酶在多種腫瘤及其突變體中高度表達。它可以以可逆的方式與磷酸三腺苷（ATP）的結合位點結合。對于信號的傳導，需要由兩個EGFR分子聚集在一起形成同型二聚體，然后使ATP分子在產生的磷酸酪氨酸殘基上發生互相磷酸化，將磷酸酪氨酸結合蛋白募集到EGFR上，組裝后將信號級聯傳遞到到細胞核上或激活其他細胞生化過程。當厄洛替尼與EGFR結合時，EGFR與磷酸酪氨酸殘基的形成被阻斷，從而不啟動級聯信號的傳遞[19]。

對于EGFR激酶結構域突變（通常為L858R）和外顯子19缺失的患者，他們對吉非替尼/厄洛替尼的反應性較好。盡管一項大型的Ⅲ期的臨床試驗（NCIC-BR．21）證實[20]，厄洛替尼可以延長肺癌患者的生存期，但大多數未經過基因篩選的肺癌患者仍然對厄洛替尼敏感性較差。基因型為野生型EGFR的肺癌患者往往從一開始就對厄洛替尼無反應，突變型EGFR的初始應答者也有可能發展為二次藥物抵抗。所以對于厄洛替尼無效或效果不佳的肺癌患者，需要尋找一種新的途徑來解決問題[9]。

在實驗設計中，首先通過使用不同濃度的青蒿素和厄洛替尼對A549細胞的作用，來篩選抑制該細胞活性的最佳濃度組合，最終發現聯合使用青蒿素和厄洛替尼，比單獨使用這兩種之一能更有效抑制細胞的活性，對細胞的殺傷作用更強。凋亡在腫瘤的發展和進展具有重要的生物學意義。眾多化療藥物通過誘導產生腫瘤細胞凋亡以達到抗腫瘤作用。既往的研究發現，青蒿素可以通過內源性途徑誘導細胞凋亡[21]。本實驗的第2個實驗探究青蒿素和厄洛替尼是否能誘導細胞凋亡中使用流式細胞術來確定細胞死亡的模式。最終結果表明，在青蒿素+厄洛替尼處理后，A549細胞的凋亡率達到90%。這證明了青蒿素和厄洛替尼能協同促進A549細胞凋亡。

在體內實驗中，研究了青蒿素和厄洛替尼對小鼠體內腫瘤的治療效果。腫瘤內注射越來越多地被應用于治療腫瘤[22]。在本研究中，筆者使用腫瘤內注射治療荷瘤小鼠，并觀察到青蒿素和厄洛替尼聯合用藥對腫瘤的抑制作用顯著。

綜上所述，青蒿素和厄洛替尼對A549細胞的抑制上表現出協同性。同時青蒿素和厄洛替尼通過誘導腫瘤細胞凋亡來達到對腫瘤的抑制作用。體內實驗中，聯合使用青蒿素和厄洛替尼對腫瘤的抑制有顯著的效果。這項研究的結果對肺癌的治療方案提供了一種新的思路。

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