日本豬δ冠狀病毒的遺傳特征及致病性

杜皓云 譯

一、介紹

冠狀病毒亞科的冠狀病毒傳統上分為3個屬，即α冠狀病毒，β冠狀病毒和γ冠狀病毒。最近增加了另一種新型屬，δ冠狀病毒。在不同的宿主物種中發現了這類病毒，包括一些哺乳動物和鳥類物種。此后，2014年在美國俄亥俄州首次發現PDCoV/SDCV，并在美國的其他州也發現了這種病毒。最近在韓國，中國，泰國和老撾等亞洲國家也有發現PDCoVs。PDCoV是一種有囊膜的正向單鏈RNA病毒。

據日本農業部報道，2013年10月-2015年9月，日本已發生1 000多起PED疫情，幾乎遍布所有地區。然而，自2014年以來，研究人員對幾個豬場的腹瀉糞便樣本進行檢測，發現樣品中豬流行性腹瀉病毒（PEDV），傳染性胃腸炎病毒（TGEV），其他腸道病毒（輪狀病毒和腸道病毒）呈陰性。之前有研究報道稱，在PEDV流行的美國一些地區，患豬的糞便樣本中可同時檢出PDCoV。此外，已經有三個研究小組證明PDCoV在實驗感染的豬中具有致病性。因此，這些發現表明PDCoV是除PEDV之外，在日本的多個豬場引起腹瀉暴發的主要病原體之一。

本文中研究人員對2013年至2014年間來自腹瀉豬的大量糞便樣本的PDCoV進行了特定PCR檢測，以確認PDCoV在日本的流行，此外，研究人員使用新一代測序技術確定了7個日本PDCoV毒株的完整基因組序列，并使用這些序列通過比較和遺傳進化分析來表明日本PDCoV毒株與其他國家公布的PDCoV毒株之間的遺傳關系。此外，研究人員對YMG/JPN/2014的日本PDCoV毒株接種剖宮產初乳剝奪的仔豬進行了致病性研究。

二、 材料和方法

1.PDCoV的樣品采集。樣品來自在2013年11月—2014年8月期間，日本全國17個地區的多個養豬場發生腹瀉仔豬或豬。研究人員對477份糞便樣品進行了PDCoV的特異性PCR檢測，樣品中的PEDV，TGEV和其它腸道病毒（輪狀病毒和腸道病毒）特異性PCR檢測結果呈陰性。將糞便樣品制備成在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋的10%懸浮液，4℃，3 000g 離心 10min。 使 用 QIAamp病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。通過實時熒光定量PCR（RTPCR）來檢測糞便樣品中的病毒。

2.全基因組測序和進化分析。使用 PrimeScripthigh Fidelity RT-PCR試劑盒，用隨機6聚體引物從72個PDCoV特異性PCR陽性樣品中合成DNA（cDNA）。從cDNA中產生幾乎完整的基因組，其由8個重疊的擴增子組成（約4 kb長）。將8個擴增子以等量合并，并使用新一代測序技術進行分析。

3.病毒分離。將豬睪丸（ST）細胞維持在補充有10%胎牛血清（FBS）的生長培養基中。將6孔板中每孔ST細胞接種200μl 10%腸內懸浮液，這些懸浮液含有5 μg/ml胰蛋白酶而不含FBS的生長培養基稀釋。在37℃和5%CO2培養箱中培養1h后移除接種物，并用不含FBS的生長培養基洗滌細胞3次，并對每孔細胞加入3ml胰蛋白酶培養基。直到觀察到以圓形細胞為特征的細胞病變效應（CPE），以 5d的間隔在ST細胞中傳代分離的病毒。用胰蛋白酶培養基連續稀釋該病毒原液10倍，并以每孔100μl接種于96孔板中生長的ST細胞中，每次稀釋8個孔。該平板在37℃，5%CO2下孵育7d。每日監測病毒CPE，根據Reed和Muench描述的方法測定病毒滴度，并表示為TCID50/ml。

4.動物實驗設計。從兩種特定的無特定病原體母豬中獲得了初乳缺乏的新生仔豬，它們對傳染原非常敏感。將11只小豬（3日齡）隨機分成兩組：接種日本PDCoV分離株，YMG/JPN/2014的組1和組2（陰性對照組）。第1組的個體口服接種2×106TCID50/頭的病毒量。從接種后 0d（DPI）至 8d（DPI）每天收集每只小豬的糞便樣品，然后第8dPI后每3～4d收集每只小豬的糞便樣品。從0dPI至8dPI每隔2d從每只小豬采集血清樣品，在8dPI之后每3～4d采集血清樣品。分別在4和7dPI 從組1中隨機挑3只和組2中挑1只仔豬處安樂死進行病理學檢查，監測每組剩余的仔豬的臨床表現和病毒排放直至27dPI。為了檢查病毒分布情況，從接種PDCoV和對照的小豬中采集小腸和大腸及其他器官。

根據上述方法從動物收集的10%糞便懸浮液，血清和10%組織勻漿中提取病毒RNA。通過RTPCR確定糞便，血清和各種組織中的病毒含量。

5.PDCoV特異性兔抗血清的制備。研究人員從美國國家獸醫服務實驗室獲得美國PDCoV分離株，Michigan/8977/2014株，以產生PDCoV的兔抗血清。

通過間接免疫熒光測定法（IFA），研究人員使用FITC標記的山羊抗兔IgG抗體評估其針對PDCoV的兔抗血清在接種美國PDCoV分離株的ST細胞上的特異性。此外，通過IFA評估與PDCoV特異性兔抗血清的交叉反應，但是抗血清不與PEDV和TGEV反應。通過IFA評估與PDCoV特異性兔抗血清的交叉反應，但抗血清不與PEDV和TGEV反應。

6.免疫組織化學（IHC）。在 4dPI，7DPI和 27dPI下接種 PDCoV的和對照小豬的小腸和大腸以及其他器官用10%福爾馬林浸泡，石蠟包埋，切片，并安裝在載玻片上。用PDCoV特異性兔抗血清作為第一抗體用二氨基聯苯胺作為第二標記抗體對組織進行染色。

三、結果

1.日本PDCoV流行概況。在使用477個糞便樣品的PDCoV調查中，根據PDCoV特異性實時RTPCR，72個樣品（15.1%）呈陽性。表1總結了各年齡組PDCoV陽性樣本的檢出率。根據PDCoV的特異性PCR，母豬中幾乎有一半（48.3%）為陽性。育肥豬（120日齡以上）和斷奶仔豬（21～60日齡）分別以10.5%和10.3%顯示次高的陽性率。另外，研究人員的調查顯示自2014年2月以來，PDCoV在日本一直存在。

2.全基因組測序和進化分析。使用新一代測序技術分析7個日本PDCoV毒株的完整基因組。表2總結了7種日本PDCoV毒株的信息。基于完整基因組的進化分析表明，2014年在日本檢測到的7種PDCoV毒株與從2013年到2016年在美國和韓國的檢測的PDCoV毒株相關，來自日本和其他國家的PDCoV毒株的基因組比較分析顯示，日本PDCoV毒株的完整基因組與美國和韓國PDCoV毒株幾乎完全相同（99.7%～100%同一性），這些毒株與包括香港PDCoV毒株的中國PDCoV毒株和泰國，越南和老撾PDCoV毒株相比具有相當的差異（表3）。

3.病毒分離。分離的病毒在ST細胞中有效地繁殖3代。通過RTPCR和免疫熒光測定，將分離株YMG / JPN / 2014 評估為 PDCoV。該分離株在ST細胞中另外繁殖4次，當用于實驗研究時其滴度為106TCID50/ml。

4.臨床癥狀和排毒。接種PDCoV的新生仔豬在2～11dPI期間出現急性水樣腹瀉，厭食，毛發枯燥和嚴重的虛脫，然后在整個觀察期間全部恢復并存活。在PDCoV接種的小豬的糞便和血清樣品中檢測到的PDCoV RNA顯示在圖2中。用日本PDCoV分離株接種

通過使用RT-PCR，在4和7DPI檢查PDCoV接種組的各種組織中的病毒分布（圖3）。在接種PDCoV的組中，病毒主要在從近空腸到直腸的腸組織中檢測到，并且在4dPI時在腸系膜淋巴結中以108～1010拷貝/ml的范圍檢測到病毒。此外，4dPI時，PDCoV特異性PCR還檢測到來自肝臟，2/3的胃，十二指腸樣品和1/3肌肉樣品的超過107的病毒RNA拷貝。在7DPI時，病毒主要分布在大腸。此外，從腸系膜淋巴結和2/3遠端空腸和回腸樣本中檢測到超過107個病毒基因組拷貝。根據PDCoV特異性PCR，陰性對照組中的所有仔豬，血清和組織樣品均為陰性。

5.免疫組織化學。在4DPI尸檢時使用PDCoV特異性兔抗血清（表5），IHC染色檢測來自PDCoV接種組的樣品中從近端空腸至結腸的絨毛細胞質和隱窩腸上皮細胞PDCoV抗原。PDCoV接種仔豬的平均IHC評分在空腸近端和盲腸至結腸低，中腸空腸至回腸高，十二指腸和直腸陰性。在7dPI，病毒主要分布在大腸，從盲腸到結腸病毒含量低。在27dPI時，在PDCoV接種組的任何組織中未鑒定到陽性染色。在陰性對照小豬的所有檢查組織中未檢測到IHC染色。

四、 討論

研究人員的調查顯示，在2013年-2014年，在日本幾個縣的腹瀉豬中獲得477個PEDV，TGEV和其他腸道病毒陰性糞便樣品中，有72個樣品（15.1%）PDCoV呈陽性。PDCoV陽性樣本的檢出率與2014年1～2月在美國收集的豬樣本調查中觀察到的相似（22%）。因為研究人員沒有收集腹瀉樣本的豬群的詳細信息，他們的數據不能否認這些腹瀉可能是由其他病原體（細菌和寄生蟲）引起的可能性，但是表明PDCoV會與這些腹瀉相關。此外，他們的數據還表明，PDCoV可以感染所有年齡組，類似于PEDV。特別是，研究者的調查顯示了帶PDCoV的母豬為最高的陽性檢測率。事實上，美國首次發現PDCoV的報道顯示，美國的PDCoVs是在患有水樣腹瀉的母豬檢測到的。在臨床觀察中，母豬不僅表現出嚴重的腹瀉，還表現出嘔吐和厭食。這些發現表明，老年豬對PDCoV可能比仔豬更敏感。然而，其假設將需要在未來進行進一步驗證。

利用基因組序列構建進化樹表明，日本檢測到的7種PDCoV毒株與在2013—2016年來自美國和韓國的毒株相似。日本收集的PDCoV毒株與2004—2016年在其他國家收集的PDCoV毒株的基因組比較分析顯示，來自日本的PDCoV毒株的完整基因組幾乎與來自美國和韓國的完全基因組相同（99.7～100%）。因此，自2014年以來在日本出現的PDCoV毒株與自2013年以來在美國和韓國出現的那些毒株在遺傳上有關。此外，2014年以來發生在日本的PDCoV暴發可能是由于來自其他大型豬業的PDCoV毒株入侵日本而造成的。

為了測試YMG/JPN/2014毒株的致病性，使用剖宮產初乳剝奪的新生仔豬進行實驗性感染。在臨床觀察中，感染該毒株后少數仔豬中出現輕度腹瀉，無嘔吐和厭食，但感染后的仔豬在5d后從腹瀉中恢復。相比之下，用日本PDCoV分離株接種的仔豬在2dPI時患有嚴重腹瀉，但是在11dPI時全部從腹瀉中恢復，并且存活直至27dPI。因此，PDCoV分離毒以及野毒使仔豬產生了腹瀉。然而，研究中仔豬腹瀉的嚴重程度和持續時間的差異可能是由不同的條件引起的，如接種量或宿主的易感性。

總之，研究人員首先發現自2014年2月以來PDCoV已在日本出現。他們的分析表明，自2013年底以來，PDCoV可能是導致日本豬群腹瀉的暴發的病原體。由于該研究中檢測到的PDCoVs與2013年以來在其他豬生產國家（如美國和韓國）出現的毒株有關，它們可能代表海外入侵，如PEDV入侵日本。