c-Met基因過表達臍帶間充質干細胞株的構建*

張永婷，朱傳龍，李軍，章莉莉

目前進行細胞移植治療的種子細胞主要來源于自體骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC），但因取材有創，獲得細胞數量有限。隨著年齡增長，人體骨髓MSC細胞數量及細胞活性明顯下降。人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUMSC）作為工具細胞，具有分化潛能強、來源豐富、無倫理爭議等優點，同時免疫原性低、免疫調控功能和自我更新能力強大，可作為治療肝衰竭的種子細胞[1]。趙思達將hUMSC移植到肝衰竭大鼠體內后發現能顯著改善肝功能，減輕肝臟損傷，促進肝細胞再生，提高了動物存活率[2]。細胞間質表皮轉化因子（cellular mesenchymal to epithelial transition factor，c-Met）是肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的特異性受體，由50 kD的α鏈和145 kDa的β鏈通過二硫鍵組成異源二聚體[3]。C-Met與HGF特異性結合后，酪氨酸激酶自主磷酸化激活下游信號轉導通路，發揮促進細胞增殖、遷移、血管生成、抗纖維化、抗凋亡等作用[4-6]。Trapp T et al[7]發現 HGF/c-Met軸可促進間充質干細胞遷移至損傷部位。間充質干細胞c-Met表達量與其遷移能力密切相關[8]。還有研究結果表明肝臟損傷后HGF水平增加，可上調MSC中c-Met與磷酸化Met的表達，促進MSC遷移至肝臟，進一步減輕肝損傷[9]。敲除c-Met基因能損傷干細胞的遷移及向肝細胞分化能力，并進一步抑制了肝組織的修復[10]。本文旨在建立c-Met基因過表達的hUMSC，并移植治療肝衰竭大鼠，觀察該方法是否可促進hUMSC遷移至受損肝臟部位，并觀察其向肝細胞分化的能力。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器 人臍帶間充質干細胞（由江蘇省人民醫院干細胞臨床實驗研究基地提供），胎牛血清（Corning公司，美國），DMEM 低糖培養基（HyClone公司，美國），PBS粉末（Sigma公司，美國），重組人表皮生長因子（hEGF）和重組人生長因子（hEGF）（PeroTech公司，美國），胰蛋白酶（碧云天公司），抗人 CD31、CD34、CD44、CD45、CD90 和CD109抗體（Biolegend公司，美國），構建成功慢病毒重組載體GV358-c-Met（上海吉凱公司），嘌呤霉素（Amresco公司，美國），凝聚胺（Sigma公司，美國），兔抗人c-met（abcam公司,英國），兔抗人β-actin（abcam公司,英國），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 lgG（杭州聯科公司），細胞培養箱（Thermo公司），超凈臺和熒光倒置相差顯微鏡（Olympus公司)，制冰機（廈門國儀科學儀器公司）。

1.2 人臍帶間充質干細胞體外培養與鑒定 取凍存P2代hUMSCs，37℃水浴復蘇后鋪板，使用含10%血清，10 ng/ml的hEGF和hbFGF低糖DMEM培養,培養至P5代細胞。取P5代hUMSC進行流式細胞儀鑒定，分別取100μlhUMSC細胞懸液，加入到流式管中，每管細胞總數為1×105個。分別在各流式管中加入抗體 PE-CD31、PE-CD34、PE-CD45、FITC-CD44、FITC-CD45和FITC-CD105，隨后避光冰浴30 min，PBS洗滌后離心，放入流式細胞儀檢測，并記錄結果。

1.3 確定嘌呤霉素篩選濃度 取對數生長期的hUMSC，接種于6孔板，待2～3 d各孔細胞長滿后，重新各孔加入含梯度濃度嘌呤霉素的完全培養基2 ml，各孔嘌呤霉素濃度分別為 0 μg/ml、1 μg/ml、1.4 μg/ml、2 μg/ml、3 μg/ml和 4 μg/ml，顯微鏡下每日觀察各孔細胞生長情況。2～3 d換液，加入含有相應濃度嘌呤霉素的完全培養基，以4 d可完全殺死相應孔中全部細胞的最低嘌呤霉素濃度為最終藥物篩選濃度。

1.4 最適多重感染復數（multiple of infection,MOI）的篩選 轉染前24 h，取第五代hUMSCs，以5×104個/ml接種于96孔培養板，使轉染時細胞融合至30%～40%。次日，用含有5 μg/ml polybrene的新鮮培養基200μl替換原培養基，加入滴度為2×108TU/ml，MOI 依 次 為 0、10、30、50、80、100 的c-Met病毒懸液，37℃孵育。12 h后，加入新鮮培養基200μl，繼續培養，48 h后于熒光倒置顯微鏡下觀察轉染情況，陽性細胞在熒光顯微鏡下顯示為綠色，計算同一視野下陽性細胞與總細胞數百分比。根據以下公式計算轉染效率：轉染效率=綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞數/總細胞數×100%。轉染效率90% 以上的最低MOI值即為最適MOI。

1.5 c-Met重組慢病毒轉染人臍帶間充質干細胞及轉染后嘌呤霉素的篩選 取第五代hUMSCs，以5×105個/ml接種于24孔培養板，分為對照組和實驗組，每組設置3個復孔。按照上述方法進行轉染，實驗組按最佳 MOI值加入重組慢病毒Lenti-GFP-c-Met，對照組加入等體積的陰性病毒液Lenti-GFP，48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，72 h后向培養基中加入最終濃度的嘌呤霉素篩選。1 w后，在熒光顯微鏡下觀察篩選效果，待顯微鏡下熒光效率接近或者高于99%時，將藥物濃度維持在1/5篩選濃度，即獲得穩定表達c-Met基因的臍帶間充質干細胞株。

1.6 穩定轉染細胞株c-Met蛋白表達的檢測 采用Western blot法，分別取實驗組和對照組相同數目的細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，采用冷凍干燥技術調整各個蛋白樣品濃度為5 g/L。隨后，取待測樣品與5×蛋白上樣緩沖液按照4:1體積進行混合，充分混勻后，放于沸水中煮5 min，裝置好電泳設備，每孔按照20μg蛋白量上樣，根據已知濃度算出每孔對應蛋白體積，加入Marker 10μl，進行 10%SDS-PAGE電泳。進行PVDF膜轉膜，TBST緩沖液洗膜，室溫封閉2 h，分別加兔抗人c-Met（1∶500），兔抗人β-actin（1∶1 000），4℃過夜，用TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫下孵育 2 h。用TBST緩沖液洗膜，按ECL試劑盒說明進行化學發光檢測，暗室中進行X線片曝光顯色，使用Image J軟件進行條帶灰度分析。

2 結果

2.1 臍帶間充質干細胞的培養與鑒定情況 培養至P5代的hUMSC細胞呈長梭形，或旋渦狀生長，細胞排列緊密，大小一致，形態均一（圖1）。經流式細胞儀檢測顯示P5代細胞表面CD44、CD90和CD105表達陽性均在96%以上（分別為99.7%、97.7%和96.4%），而CD31、CD45和CD34表達均低于3%（圖2），上述結果符合間充質干細胞特性。

圖2 第五代hUMSC表面鑒定結果A:CD105+，CD34-；B:CD90+，CD45-；C:CD44+，CD31-

2.2 篩選嘌呤霉素藥物濃度情況 經不同濃度的嘌呤霉素處理hUMSCs 4 d，在顯微鏡下觀察發現在藥物濃度為1.4 μg/ml時，即可殺死全部細胞，故最終確定嘌呤霉素篩選濃度為1.4 μg/ml（圖3）。

圖3 不同濃度嘌呤霉素篩選1 w結果（40×）A:0 μg/ml；B:1 μg/ml；C:1.4 μg/ml

2.3 c-met重組慢病毒載體轉染hUMSCs及轉染后嘌呤霉素篩選情況 在轉染48 h后，在熒光顯微鏡下即可見綠色熒光，GFP陽性細胞占總細胞的50%（圖4）；在轉染72 h后，加入嘌呤霉素篩選，濃度為1.4μg/ml。經藥物篩選1 w后在熒光顯微鏡下觀察熒光，發現熒光陽性率大于99%（圖 5），即形成穩定表達c-met基因的人臍帶間充質干細胞株（c-met-hUMSC），收集細胞凍存、備用。

2.4 c-met-hUMSC細胞c-Met蛋白表達情況 經Western blot檢測顯示，穩定轉染c-met的hUMSCs細胞顯著表達c-Met蛋白，明顯高于對照組hUMSCs的c-met表達水平（圖 6）。

圖4 培養細胞表現 hUMSCs轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光（MOI=80，40×）A：白光視野；B：熒光視野

圖5 培養細胞表現 經嘌呤霉素篩選hUMSC 1 w后在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光（40×）A：白光視野；B：熒光視野

圖6 細胞c-Met蛋白表達情況A：穩定轉染 c-Met的 hUMSCs組；B：hUMSCs組

3 討論

其中MSC是一類來源于中胚層非造血的干細胞，其可體外增殖、分化、歸巢至損傷部位，改善炎性微環境[11，12]。MSC 主要從骨髓、脂肪、臍帶中提取[13]，與骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞相比，hUMSC具有一些優勢：①無創性。臍帶作為醫學廢物不會給捐獻者造成新的創傷和痛苦；②來源豐富。每年有大量新生兒出生，一般不涉及醫學倫理學問題；③hUMSC 表達OCT-4、Sox-2、Nanog等轉錄因子，原始且免疫原性低，同時具有更強的增殖能力和可塑性；④hUMSC在體內外誘導因素作用下可分化為肝樣細胞[14]。大量實驗證明輸入MSC到體內后并沒有長期停留，而且隨著時間的延長被機體清除。將人MSC通過頸靜脈移植到大鼠體內，1 h后，大鼠體內檢測到的MSC已減少到了82%左右，8 d后只能檢測到0.06%。外周靜脈輸入MSC后，大部分MSC滯留在肺部，然后隨著血流到達肝臟等部位[15]。臨床研究結果亦表明移植MSC在短期內可改善肝衰竭患者病情，但長期觀察肝功能無明顯變化[16，17]。

在肝衰竭發生過程中，肝臟間質細胞產生大量的HGF，后者通過與受體c-Met結合形成信號通路，促進細胞再生，誘導細胞遷移等[18]。C-Met作為HGF的特異性受體，具有酪氨酸激酶活性，可促進細胞增殖分化、形態發生和侵襲運動。但肝細胞再生取決于肝細胞表面細胞膜上c-Met的激活，而不是單純HGF的水平增加。敲除小鼠c-Met基因嚴重影響肝細胞的存活和肝組織修復功能[19]。肝衰竭大鼠血清HGF水平升高，但c-Met蛋白表達水平卻明顯降低[20]。肝大部切除大鼠血清HGF和c-Met水平均升高，表明c-Met在肝細胞再生中起到重要作用。以上研究結果提示可以通過基因修飾，以提高hUMSC細胞c-Met的表達，移植c-Met高表達的hUMSC細胞能夠更好地定向歸巢于損傷肝組織。基因治療作為一種治療手段已初見成效，其中載體細胞的選擇至關重要，hUMSC可自我更新，分化為肝樣細胞，異體移植時不易發生免疫排斥反應，成為組織工程研究的熱門工具細胞。同時，慢病毒載體轉染干細胞能力強，能夠保證目的基因長期高效表達，且細胞毒性較低。

本實驗通過構建慢病毒重組載體GV358-c-Met轉染hUMSCs，用嘌呤霉素抗性基因篩選后獲得成功穩定表達c-Met基因的hUMSC細胞。該細胞的建立為下一步觀察c-Met是否促進hUMSC歸巢于損傷肝臟組織，促進肝細胞再生，以及以后是否可作為治療肝衰竭患者的一種新方法提供了實驗基礎。

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