慢性丙型肝炎外周血miR-1273g-3p水平變化及其診斷肝纖維化分期的效能分析*

王婧婧，張瑜，董娜，韓振坤，翟景明

隨著分子生物學的發展，有關肝纖維化的研究重點逐漸轉移至與纖維化發生相關的基因研究上，如MicroRNA（miRNA）是一種非編碼單鏈RNA，長約22 nt[1-5]。在靜息狀態下，人類HSC與激活后的HSC存在miRNAs水平差異[6]。本研究檢測了慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）患者外周血miR-1273g-3p水平變化，并分析了其與肝纖維化分期的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年2月～2017年2月我科收治的CHC患者57例，男35例，女22例；年齡20～52歲，平均年齡（36.1±7.8）歲。符合《慢性丙型肝炎防治指南》的診斷標準，排除甲型、乙型、戊型肝炎病毒和HIV混合感染者，排除酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病，排除合并嚴重的內分泌系統、腦血管系統疾病和惡性腫瘤、預計生存期短于4個月患者。另選擇同期在我院健康體檢者21例作為對照，男性15例，女性6例；平均年齡（35.2±5.6）歲。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有受試者簽署相關知情同意書。

1.2 肝穿刺活檢術 囑患者取平臥位或左側臥位，在B超引導下選擇穿刺點和進針途徑，先后取出肝組織2～3條，置入10%甲醛溶液中固定、送檢。在肝組織病理學檢查時，采用Metavir評分判斷肝纖維化程度，F0：無纖維化；F1：局限性匯管區纖維增生，竇周和小葉內纖維化；F2：纖維化擴大至匯管區周圍，伴纖維間隔形成，肝小葉結構保留；F3：纖維間隔形成伴小葉結構紊亂，無肝硬化；F4：早期肝硬化。

1.3 治療方法 給予患者長效干擾素-α2b聯合利巴韋林標準療法治療12 m。

1.4 臨床檢測 抽取空腹外周靜脈血5 ml，常規檢測血生化、抗-HCV和HCV RNA。

1.5 血清miR-1273g-3p水平測定 采集所有待檢人員外周靜脈血3 ml，分離血漿，在4℃下12000 r/m離心12 min，吸取血清250μl，加入1.5 ml Eppendorf離心管，加入相關內參對照和試劑，在漩渦器上充分混勻，放置5 min，使用改良的miRNA提取方法提取miRNA，并測定其純度和濃度。測定完畢后，行逆轉錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測，本研究所用引物序列見表1。

1.6 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。采用Spearman秩相關分析miR-1273g-3p水平與肝纖維化分期的相關性。繪制受試者工作特征曲線（ROC）并計算miR-1273g-3p曲線下面積，評價其診斷肝纖維化分期的效能。

表1 引物序列

2 結果

2.1 CHC患者與健康人血清miR-1273g-3p水平比較 與健康人比，存在肝纖維化的CHC患者血清miR-1273g-3p水平顯著升高，而顯著肝纖維化患者血清miR-1273g-3p相對水平顯著高于輕度肝纖維化患者（P＜0.05，表2）。相關性分析結果顯示，CHC患者血清miR-1273g-3p水平與肝纖維化分期呈正相關（r=0.657,P＜0.001）。

2.2 CHC患者血清miR-1273g-3p相對水平變化 在抗病毒治療12 m末，CHC F0期、F1-2期和F3-4期患者血清miR-1273g-3p相對水平依次變化為（1.03±0.4）、（1.43±0.22）和（3.97±0.2），均顯著低于治療前（P＜0.05）。

表2 CHC患者與健康人血清miR-1273g-3p水平（±s）比較

表2 CHC患者與健康人血清miR-1273g-3p水平（±s）比較

與健康人或CHC F0期比，①P＜0.05；與F1-2期比，②P＜0.05

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2.3 血清miR-1273g-3p水平診斷肝纖維化分期的效能分析 在治療前，分別以血清miR-1273g-3p水平＞1.68和血清miR-1273g-3p水平＞4.20為截斷點診斷存在肝纖維化和顯著肝纖維化，其ROC曲線下面積（AUC）分別為 0.830，95%CI為0.714～0.973，診斷的靈敏度為72.2%，特異度為86.4%，和0.864，95%CI為 0.701～0.976，診斷的靈敏度為83.6%，特異度為78.4%（圖1）；在治療后，經肝組織病理學檢查發現CHC患者F0期、F1期、F2期、F3、F4期依次為 15例、9例、14例、11例、8例。血清miR-1273g-3p水平診斷存在肝纖維化和顯著肝纖維化的AUC分別為0.814，95%CI為0.768～0.945，診斷的靈敏度為71.4%，特異度為82.7%，和為0.853，95%CI為0.841～0.959，診斷的靈敏度為80.3%，特異度為84.2%（圖2）。

圖1 血清miR-1273g-3p診斷肝纖維化的效能分析（治療前）

圖2 血清miR-1273g-3p診斷肝纖維化的效能分析（治療后）

3 討論

人類miRNA家族包含1424種前體編碼的1733種成熟miRNA。雖然miRNA序列數量僅占人類基因序列的1%～3%，但參與近1/3基因水平的調控，在機體生長發育、細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發生中發揮著重要的作用[8，9]。近年來，眾多研究[10，11]發現miRNA在肝臟分化、形態維持和功能維護中發揮重要的作用。另有最新研究顯示[12]，miRNA分子不僅存在于細胞中，還可出現在循環中。miRNA對RNA酶的降解反應穩定，可作為活躍的生物學標志物，但不同疾病血清miRNA分子水平不同，不同組織的miRNA分子具有組織特異性，故通過研究血清/血漿miRNA分子水平以評估患者病情發展將成為可能。

CHC的發生主要通過輸血、靜脈注射、生活密切接觸等方式傳播，感染率約為3%，其中CHC約占感染總數的70%～85%[13]。隨著肝炎的進展，部分CHC可發展為肝硬化，甚至肝癌，因早期肝纖維化是可逆的，故臨床強調早期診斷病情并予以積極治療可促進患者康復，避免肝硬化和肝癌發生[14，15]。肝組織病理學活檢是診斷肝纖維化的金標準，但屬于有創檢查，且肝組織纖維化分布不均，無法全面地評估病情發展，導致肝組織活檢存在一定的局限性[16]。

隨著分子生物學研究的深入，研究發現多種慢性肝臟疾病均伴miRNA的水平差異，如藥物性肝損傷、病毒性肝炎、酒精性肝病等，miRNA調控的靶基因，包括轉化生長因子β1、血小板衍生生長因子、腫瘤壞死因子、血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶抑制劑等多種細胞因子均可表現為不同[17]。轉化生長因子β/Smad可以抑制正常肝細胞的增殖，激發肝星狀細胞（HSC）激活，促進ECM的生成與沉積。另一反面，轉化生長因子β/Smad信號通路可導致細胞基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子上調，從而導致ECM降解降低。在組織纖維化過程中，轉化生長因子β/Smad信號通路的激活又可促進一些纖維化因子的活化，如血管內皮生長因子和整合素等。因此，miRNA在轉化通路中發揮重要的作用[18-20]。CHC患者血清轉氨酶水平與干擾素應答基因呈正相關[21]，通過對比活化型HSCs與靜息型HSCs miRNA水平，發現HSCs活化過程中明顯上調的基因包括 miR-125b、miR-132 和 miR-1273 等[22]，并有學者采用雙熒光素酶報告基因檢測驗證了miR-1273g-3p與PTEN特異性結合，提出miR-1273g-3p可能通過調控PTEN來參與肝纖維化的進展[23]。基于上述研究，本課題組檢測了不同肝纖維化程度的CHC患者血清miR-1273g-3p水平，結果發現健康人與F0期CHC患者血清miR-1273g-3p相對水平無顯著性差異，但存在肝纖維化的F1-2期組和F3-4期組血清miR-1273g-3p相對水平顯著升高，且F3-4期組水平最高，顯示出隨著肝纖維化的發展，血清miR-1273g-3p水平逐漸上升。經繪制ROC曲線分析，并計算ROC曲線下面積，結果顯示血清miR-1273g-3p相對水平具有一定的診斷肝纖維化的效能，無論在治療前還是經抗病毒治療后的CHC患者，血清miR-1273g-3p相對水平均與肝纖維化程度呈正相關。在治療前，分別以血清miR-1273g-3p水平＞1.68和血清miR-1273g-3p水平＞4.20為截斷點診斷存在肝纖維化和顯著肝纖維化，其ROC曲線下面積（AUC）分別為0.830，95%CI為0.714～0.973，診斷的靈敏度為72.2%，特異度為86.4%，和 0.864，95%CI為 0.701～0.976，診斷的靈敏度為83.6%，特異度為78.4%。在治療后，其結果也類似。由此可見，臨床醫師可把循環血miR-1273g-3p水平作為診斷肝纖維化分期的參考指標之一。

總之，循環血miR-1273g-3p水平可有效反映肝功能損害和肝纖維化程度，監測其血清水平將有助于對肝纖維化的診斷及分期判斷。但鑒于本研究樣本小，檢測方法還不穩定，可能在一定程度上影響了本研究結論的可靠性。在以后的研究中，還需要擴大樣本量，并與其他疾病檢測結果相比較，以充分論證血清miR-1273g-3p水平對肝纖維化的診斷價值。

【參考文獻】

[1]Allam A，Gabr S，Ajarem J，et al.Bcl-2 and p53 expression in hepatic tissues of Egyptian patients with chronic hepatitis C.J Pak Med Ass，2015，65:1186.

[2]Moorchung N，Vasudevan B，Dinesh K S，et al.Expression of apoptosis regulating proteins p53 and bcl-2 in psoriasis.Indian J Pathol Microbiol，2015，58:423-426.

[3]Toson EA，Shiha GE，Abdelgaleel AE.Fibrogenic/angiogenic linker for non-invasive assessment of hepatic fibrosis staging in chronic hepatitis C among Egyptian patients.Ann Hepatol，2017，16:862-873.

[4]Sidorkiewicz M，Grek M，Jozwiak B，et al.The impact of chronic hepatitis C infection on cholesterol metabolism in PBMCs is associated with microRNA-146a expression.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2017，36:697-702.

[5]Hayes CN，Chayama K.MicroRNAs as biomarkers for liver disease and hepatocellular carcinoma.Int Mol Sci，2016，17:280.

[6]Chen C，Wu CQ，Zhang ZQ，et al.Loss of expression of miR-335 is implicated in hepatic stellate cell migration and activation.Exp Cell Res，2011，317:1714-1725.

[7]Cruz KJC，de Oliveira ARS，Morais JBS，et al.Role of microRNAs on adipogenesis，chronic low-grade inflammation，and insulin resistance in obesity.Nutrition，2017，35:28-35.

[8]Almas I，Afzal S，Idrees M，et al.Role of circulatory microRNAs in the pathogenesis of hepatitis C virus.Virus Dis，2017，28:360-367.

[9]Li ZJ，Ou-Yang PH，Han XP.Profibrotic effect of miR-33a with Akt activation in hepatic stellate cells.Cell Signal，2014，26:141-148.

[10]Liu Y，Liu Q.MicroRNAs as regulatory elements in psoriasis.Open Med（Wars），2016，11:336-340.

[11]方晨，黃惠芳，鄒偉.miRNA-肝病治療的新靶點.中國生物化學與分子生物學報，2012，28:793-796.

[12]Bandiera S，Pernot S，EI Saqhire H，et al.Hepatitis C virus-induced upregulation of MicroRNA miR-146a-5p in hepatocytes promotes viral infection and deregulates metabolic pathways associated with liver disease pathogenesis.J Virol，2016，90:6387-6400.

[13]朱傳龍，朱甜甜，王坤，等.慢性丙型肝炎患者血清Pygo2水平對肝纖維化程度的評估價值探討.實用肝臟病雜志，2017，20:161-164.

[14]Pokora A，Kiciak S，Tomasiewicz K.Assessing the consistency of liver fibrosis results obtained through biopsy and transient elastography in patients suffering from chronic hepatitis C.Clin Exp Hepatol，2016，2:109-111.

[15]Eltaher S M，El-Gil R，Fouad N，et al.Evaluation of serum levels and significance of soluble CD40 ligand in screening patients with hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma.East Mediterr Health J，2016，22:603-610.

[16]Aby E,Jimenez MA,Grotts JF,et al.Diminishing use of liver biopsy among liver transplant recipients for hepatitis C.J Clin Transl Hepatol,2017,5:197-202.

[17]Elemeery MN,Badr AN,Mohamed MA,et al.Validation of a serum microRNA panel as biomarkers for early diagnosis of hepatocellular carcinoma post-hepatitis C infection in Egyptian patients.World J Gastroenterol,2017,23:3864-3875.

[18]Guo J，Sang Y，Yin T，et al.miR-1273g-3p participates in acute glucose fluctuation-induced autophagy，dysfunction，and proliferation attenuation in human umbilical vein endothelial cells.Am J Physiol Endocrinol Metab，2016，310:734-743.

[19]Jarret A，McFarland AP，Horner SM，et al.Hepatitis-C-virusinduced microRNAs dampen interferon-mediated antiviral signaling.Nat Med，2016，22:1475-1481.

[20]Wu N，Jin L，Cai J.Profiling and bioinformatics analyses reveal differential circular RNA expression in hypertensive patients.Clin Exp Hyperten，2017，39:454-459.

[21]Marquez RT，Bandyopadhyay S，Wendlandt EB，et al.Correlation between microRNA expression levels and clinical parameters associated with chronic hepatitis C viral infection in humans.Lab invest，2010，90:1727-1736.

[22]Shaker OG，Senousy MA.Serum microRNAs as predictors for liver fibrosis staging in hepatitis C virus-associated chronic liver disease patients.J Viral Hepat，2017，24:636-644.

[23]Niu X，Fu N，Du J，et al.miR-1273g-3p modulates activation and apoptosisofhepaticstellatecellsbydirectly targeting PTEN in HCV-related liverfibrosis.FEBBS Lett，2016，590:2709-2724.