肝細(xì)胞癌患者外周血PD-L1基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌易感性及預(yù)后關(guān)系研究*

楊 娟，趙 路，劉春梅，吳 涵，曹東輝，趙 琰，張延新，郭 康

肝細(xì)胞癌（HCC）是消化系統(tǒng)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤[1]。歐洲肝臟病學(xué)會(huì)和美國肝臟病學(xué)會(huì)發(fā)布的指南推薦的治療肝細(xì)胞癌的方法包括肝切除、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、肝移植、局部消融術(shù)等[2]，這些方法治療的患者5 a生存率仍較低[3]。晚期肝細(xì)胞癌患者預(yù)后較差，化療和放療治療效果有限，主要以姑息性療法為主，患者中位生存時(shí)間短于1年[4]。近些年來，免疫療法治療肝細(xì)胞癌越來越受到重視，程序性死亡配體（programmed death-ligand 1，PD-L1）是免疫治療的重要靶點(diǎn)。PD-L1是共刺激分子B7家族的重要成員，由抗原提呈細(xì)胞表達(dá)，可抑制T淋巴細(xì)胞激活[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-L1抗體可以抑制PD-L1的細(xì)胞毒性作用，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞消滅腫瘤細(xì)胞的能力[6，7]。我們對HCC患者外周血PD-L1啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)和非編碼區(qū)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）， 即 rs4143185、rs17718883和rs2890658進(jìn)行了分析研究，以探討PD-L1與肝細(xì)胞癌易感性和患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月～2015年6月診治的HCC患者100例，均經(jīng)血清學(xué)、影像學(xué)和組織病理學(xué)檢查診斷。納入患者在采集血清前未接受過抗腫瘤治療，無自身免疫性疾病史，無其他惡性腫瘤病史。另選100例肝功能正常的正常人群作為正常對照。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 血液PD-L1基因多態(tài)性檢測 在清晨空腹采血5 mL，置于EDTA抗凝管中，凍藏于-80℃。使用E.Z.N.A.Blood DNA試劑盒（杭州希頓生物科技有限公司）提取全基因組DNA，取全血600 μl，加入1.5 ml EP管，加入紅細(xì)胞裂解液900μl、混勻，室溫下5000 g離心，3 min，加入WTL細(xì)胞裂解液 250μl，孵育 1 h，加入 BL 緩沖液 250μl，孵育10 min，再加入無水乙醇250μl，混勻，將混合液加入DNA結(jié)合柱中，8000 g離心，1 min。加入洗液500μl，8000 g離心，1 min，重復(fù)清洗1次。去除洗液，將預(yù)熱的Elution緩沖液60μl加入DNA結(jié)合柱的膜上，室溫放置10 min，12000 g，離心2 min，將DNA樣本放置于-80℃冰箱保存。采用直接測序法和聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）檢測基因多態(tài)性。在單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（dbSNP）選擇PD-L1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)：即rs2890658、rs17718883和 rs4143185。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蛞锞缮虾Ｉ锕こ逃邢薰驹O(shè)計(jì)（表1）。PCR 反應(yīng)體系如下：依次將 buffer（5μl），MgCL（22μl），模板DNA（2 μl），dNTP（2μl），上游和下游引物各 1μl，DNA 聚合酶（0.2μl），去離子水（9.8 μl）加入 0.5 mL 的 EP 管中、混勻，在 4℃離心機(jī)（美國貝克曼）3000 g下離心30 s，然后置入PCR儀（日本TAKARA）上擴(kuò)增，預(yù)變性（rs2890658:95℃ ，10 min；rs17718883：95 ℃ ，3 min；rs4143185：94℃ ，5 min）， 變 性（rs2890658:95℃，30 s；rs17718883：94 ℃，1 min；rs4143185：94℃，20 s），5 個(gè)循環(huán)，退火（rs2890658:60℃，30 s；rs17718883：55℃ ，1 min；rs4143185：55 ℃ ，30 s），延伸（rs2890658:72℃，3 min；rs17718883：72℃，1 min；rs4143185：72℃，1 min），35 個(gè)循環(huán)，延伸（rs2890658:72℃ ，10 min；rs17718883：72℃ ，1 min；rs4143185：72℃，7 min）。隨機(jī)抽取 5%DNA樣品，委托上海聯(lián)碩生物科技有限公司使用美國ABI-3500基因測序儀測序，DNA測序結(jié)果與PCR檢測結(jié)果重合率為100%。

表1 引物序列

1.3 隨訪 對所有患者進(jìn)行電話隨訪。進(jìn)展生存期時(shí)間定義為腫瘤患者從接受治療開始，到觀察到疾病進(jìn)展或者發(fā)生因?yàn)槿魏卧虻乃劳鲋g的時(shí)間。總生存時(shí)間（OS）定義為自確診之日到死亡的時(shí)間。死于其他原因的患者作為截尾事件。隨訪時(shí)間為10～48個(gè)月，中位時(shí)間為20個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，對不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以【M（IQR）】表示，采用秩和檢驗(yàn)，采用x2檢驗(yàn)分析肝細(xì)胞癌患者和正常人基因型分布是否符合哈迪-溫伯格平衡。Logistic回歸分析結(jié)果以比值比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）表示，采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)計(jì)算無進(jìn)展生存期（PFS）和OS。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 肝細(xì)胞癌患者和正常人一般資料見表2。

表2 兩組一般資料（%）

2.2 PD-L1基因SNP與肝細(xì)胞癌易感性關(guān)系 正常人PD-L1基因頻率符合哈迪-溫伯格平衡定律，具有群體代表性（表3）。PD-L1基因rs17718883位點(diǎn)與肝細(xì)胞癌易感性有關(guān)（P＜0.05），在對年齡、性別、家族史進(jìn)行校正后發(fā)現(xiàn)，rs2890658的AC雜合突變基因可以降低肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05），rs17718883的CG雜合突變基因也會(huì)降低肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05），其余基因型與肝細(xì)胞癌的易感性之間無明顯相關(guān)性（P＞0.05，表4）。

表3 正常人3個(gè)SNP基因頻率（%）

表4 兩組人群3個(gè)SNP基因型的分布和風(fēng)險(xiǎn)評估[n（%）]

2.3 PD-L1基因SNP與患者預(yù)后相關(guān)性 rs2890658位點(diǎn)的3個(gè)基因型AA、AC和CC患者中位生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1左上），合并基因型AC和CC者，中位生存時(shí)間為20個(gè)月，明顯比AA基因型者長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1右上）；，4143185位點(diǎn)的 3個(gè)基因型 CC、GC、GC患者中位生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1左下），合并GC和CC者，中位生存時(shí)間明顯長于CC者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1右下）。COX回歸分析顯示，rs4143185突變基因型者預(yù)后較好（P均＜0.05），其余基因型者預(yù)后無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05，表5）。

圖1 不同PD-L1基因型患者生存曲線 rs2890658位點(diǎn)基因型患者生存曲線（左上和右上）；rs4143185位點(diǎn)基因型患者生存曲線（左下和右下）

3 討論

2014 年，世界衛(wèi)生組織在《世界癌癥報(bào)告2014》中指出，2012年中國新增HCC病例數(shù)和死亡病例數(shù)均占全球新增病例數(shù)和死亡病例數(shù)的一半以上。在2012年，我國新增HCC病例394770例[8]。HCC的病因多樣，具體機(jī)制到目前為止尚未明了[9]。免疫療法逐漸應(yīng)用于HCC患者的治療。PD-L1作為免疫治療的主要靶點(diǎn)越來越受到重視。

已有研究表明，PD-L1基因與乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌等與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[10，11]。在人體正常免疫系統(tǒng)中，PD-L1對于維持機(jī)體免疫平衡至關(guān)重要。而在腫瘤微環(huán)境中，PD-L1表達(dá)上調(diào)，激活了PD-L1/PD-1 通路，從而介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸[12，13]。此外，PD-L1能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞無能和耗竭、腫瘤相關(guān)性抗原提呈細(xì)胞功能缺失、調(diào)節(jié)T細(xì)胞來源的抑制性細(xì)胞聚集等[14]。

表5 不同PD-L1基因SNP患者總生存時(shí)間【M（IQR）】比較

很多國外研究顯示，PD-L1多態(tài)性與胃癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等有關(guān)[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs17718883位點(diǎn)與HCC的易感性相關(guān)。多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，rs2890658 AC突變型基因可能會(huì)降低HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而rs4143185 GG突變型基因會(huì)增加HCC的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果與程仕光等研究一致[18]。攜帶rs2890658位點(diǎn)的3個(gè)基因型，即AA、AC和CC者中位生存時(shí)間在19個(gè)月左右，而合并AC和CC基因型者，中位生存時(shí)間延長。合并rs4143185位點(diǎn)GC和CC基因型者中位生存時(shí)間明顯長于攜帶CC者,結(jié)果表明rs4143185和rs2890658兩個(gè)位點(diǎn)突變型均可延長患者生存時(shí)間。但是，經(jīng)回歸分析發(fā)現(xiàn)僅rs4143185與患者生存時(shí)間相關(guān)，與有關(guān)研究結(jié)果一致[19]。rs4143185位點(diǎn)位于 PD-L1的 3’UTR上，該位點(diǎn) SNP會(huì)影響PD-L1的表達(dá)，降低PD-L1/PD-1受體與配體的結(jié)合，激活T淋巴細(xì)胞對癌細(xì)胞的免疫殺傷，控制癌細(xì)胞生長，進(jìn)而延長患者的生存時(shí)間。rs2890658位于內(nèi)含子區(qū)，對于PD-L1基因的表達(dá)影響較小[20]。

本研究的局限性在于：1）樣本量較小，使得研究結(jié)果需要擴(kuò)大驗(yàn)證；2）本研究為回顧性研究，未來需要隊(duì)列研究來證實(shí)本研究的結(jié)果；3）這三個(gè)基因位點(diǎn)具體如何發(fā)揮作用還需要進(jìn)一步探討；4）本研究未對PD-L1基因多態(tài)性與治療手段進(jìn)行相關(guān)性分析。有研究發(fā)現(xiàn)[21]，PD-L1基因rs2301113位點(diǎn)可以作為HCC患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。這方面是本課題組今后研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

PD-L1基因rs2890658位點(diǎn)和rs17718883位點(diǎn)SNP與HCC易感性有關(guān)，而rs2890658位點(diǎn)和rs4143185位點(diǎn)SNP可能與HCC患者預(yù)后有關(guān)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Ghouri YA，Mian I，Rowe JH.Review of hepatocellular carcinoma:Epidemiology，etiology，and carcinogenesis.J Carcinog，2017，16（1）:1-8.

[2]Borzio M，F(xiàn)ornari F，De SI，et al.Adherence to American Association forthe Study ofLiverDiseases guidelines for the management of hepatocellular carcinoma:results of an Italian field practice multicenter study.Fut Oncol，2013，9（2）:283-294.

[3]Gavriilidis P，Askari A，Azoulay D.Survival following redo hepatectomy vs radiofrequency ablation for recurrent hepatocellular carcinoma:a systematic review and meta-analysis.HPB（Oxford），2017，19（1）:3-9.

[4]Altekruse SF，Mcglynn KA，Reichman ME.Hepatocellular carcinoma incidence，mortality，and survivaltrendsin the United States from 1975 to 2005.J Clin Oncol，2009，27（9）:1485-1491.

[5]Groeger S，Howaldt HP，Raifer H，et al.Oral squamous carcinoma cells express B7-H1 and B7-DC receptors in vivo.Pathol Oncol Res，2017，23（1）:1-12.

[6]Dinesh RK，Hahn BH，Singh RP.PD-1，gender，and autoimmunity.Autoimmun Rev，2010，9（8）:583-587.

[7]曹霖霖，張國梁.慢性乙型肝炎患者PD-1/PD-L1信號(hào)通路的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展.實(shí)用肝臟病雜志，2015，18（6）:682-686.

[8]Desantis CE，Lin CC，Mariotto AB，et al.Cancer treatment and survivorship statistics，2014.CA Cancer J Clin，2012，62（4）:252-271.

[9]Kettenbach J，Stadler A，Katzler IV，et al.Drug-loaded microspheres for the treatment of liver cancer:review of current results.Cardiovasc Intervent Radiol，2008，31（3）:468-476.

[10]Le BS，Champiat S，Routier E，et al.Onset of connective tissue disease following anti-PD1/PD-L1 cancer immunotherapy.Ann Rheum Dis，2017（12）3:1-9

[11]Mletzko S，Pinato DJ，Robey RC，et al.Programmed death ligand 1（PD-L1） expression influences the immune-tolerogenic microenvironment in antiretroviral therapy-refractory Kaposi's sarcoma:A pilot study.Oncoimmunology，2017，6（8）:e1304337.

[12]Blank C，Mackensen A.Contribution of the PD-L1/PD-1 pathway to T-cell exhaustion:an update on implications for chronic infectionsand tumorevasion.CancerImmunolImmunother，2007，56（5）:739-745.

[13]萬和荷，劉麗麗，侯勇，等.PD-1/PD-L1信號(hào)通路與慢性乙型肝炎. 實(shí)用肝臟病雜志，2014，17（6）:661-664.

[14]Teng MW，Ngiow SF，Ribas A，et al.Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1.Cancer Res，2015，75（11）:2139-2145.

[15]Wang W，Ping L，He Y.A gene polymorphism in PD-L1 promoterregion is notassociated with PD-L1 expression and patients’survivalin gastric cancer.Cancer ImmunolImmunother，2017，32（3）:1-3.

[16]Lee SY，Jung DK，Jin EC，et al.PD-L1 polymorphism can predict clinical outcomes of non-small cell lung cancer patients treated with first-line paclitaxel-cisplatin chemotherapy.Sci Rep，2016，6（4）:125-125.

[17]Mojtahedi Z，Mohmedi M，Rahimifar S，et al.Programmed death-1 gene polymorphism（PD-1.5 C/T） is associated with colon cancer.Gene，2012，508（2）:229-237.

[18]程仕光，李清，彭宇，等.PD-L1基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌易感性以及預(yù)后之間的關(guān)系.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39（5）:487-492.

[19]Wang W，Li F，Mao Y，et al.A miR-570 binding site polymorphism in the B7-H1 gene is associated with the risk of gastric adenocarcinoma.Hum Genet，2013，132（6）:641-648.

[20]Zhou RM，Li Y，Liu JH，et al.Programmed death-1 lignd-1 gene rs2890658 polymorphism associated with the risk of esophageal squamous cell carcinoma in smokers.Cancer Biomark，2017:1-7.

[21]Mu CY，Huang JA，Chen Y，et al.High expression of PD-L1 in lung cancer may contribute to poor prognosis and tumor cells immune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic cells maturation.Med Oncol，2011，28（3）:682-688.