肝細胞癌患者血清和肝組織microRNAlet-7水平及其與臨床預后的關系*

張金蓮，蔡兆根，吳瓊，秦燕子，王夢慧，董修芹

microRNA分子是一類非編碼微小RNA，被臨床試驗證實與腫瘤的發生發展有關[1-3]。let-7家族屬于microRNA中的一員。研究報道指出，let-7在肺癌和乳腺癌等多種腫瘤細胞中呈低水平狀態，有抑制腫瘤生長和腫瘤細胞轉移的作用[4，5]。為進一步研究let-7家族與肝細胞癌（HCC）發生發展的關系，本文檢測了54例HCC患者血清和腫瘤組織let-7a和let-7b水平，并分析了其與患者預后的關系，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年4月～2016年6月在我院接受治療的HCC患者54例，男性42例，女性12例；年齡為35～64歲，平均年齡（49.8±10.6）歲。符合《原發性肝癌診療規范》的診斷標準，同時排除存在精神類疾病或已進行放化療者，其中TNM I期28例，Ⅱ期6例，Ⅲ～IV期20例；腫瘤直徑＜5 cm者23例，≥5 cm者31例；無血管浸潤者33例，有血管浸潤者21例。另選擇同期來我院進行體檢的52例健康人作為對照組，男性38例，女性14例；年齡33～62歲，平均年齡（50.1±10.9）歲。兩組年齡和性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 血清和肝組織microRNA let-7a和let-7b水平檢測 采集外周血4 ml，靜置于室溫下，待血清凝固后4000 r/min離心10 min，將上層血清置入無RNA酶管。取54例HCC患者手術切除的HCC組織及其癌旁組織，-80℃貯存備用。提取RNA試劑盒購自北京中杉金橋公司，熒光定量PCR試劑盒購自美國英杰公司。let-7及內參U6購自美國Proteintech公司，熒光定量PCR儀購自Thermo-Forma公司。根據miRNA逆轉錄試劑盒說明書操作。建立20 μl反應體系。反應液配比見表1（冰上完成）。將上述反應體系混合均勻，短暫離心后放置冰塊上。RT-PCR 反應條件：溫度為16℃或42℃，30 min；85℃，5 min；4℃保存。按照 qRT-PCR 試劑盒說明書操作。建立20 μl反應體系，反應液的配置情況見表2。使用Roche Light Cyeler480實時熒光定量 PCR系統進行檢測。反應參數：第一步：95℃，10 min；第二步：95℃，15 s；60℃，45 s，共40個循環。以U6為參照，計算let-7a和let-7b相對水平，計算公式為 RQ=2-△△Ct，重復測量 3 次，取平均值[6]。

表1 逆轉錄反應液配比

表2PCR反應液配比

1.3 診斷方法和病理學檢查 術前行B超和增強CT等影像學檢查，經術后組織病理學檢查診斷[7]。

1.4 統計學處理 應用SPSS 22.00統計學軟件，計量資料以±s表示，采用獨立t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清let-7a和let-7b水平比較 HCC患者血清let-7A和let-7b水平顯著低于健康人（P＜0.05，表3）。

2.2 HCC患者癌組織與癌旁組織let-7a和let-7b水平比較 癌組織let-7a和let-7a水平均顯著低于癌旁組織（P＜0.05，表4）。

表3 兩組血清let-7a和let-7b水平（±s）比較

表3 兩組血清let-7a和let-7b水平（±s）比較

例數let-7a（2-△△Ct）let-7b（2-△△Ct）HCC 54 0.6±0.4 0.3±0.1健康人 52 1.1±0.4 0.7±0.2 t 6.434 13.097 P＜0.001 ＜0.001

表4 癌組織與癌旁組織let-7a和let-7b水平（±s）比較

表4 癌組織與癌旁組織let-7a和let-7b水平（±s）比較

差異表達倍數（fold change）表示癌組織/癌旁組織let-7a和let-7b水平差異的倍數，其值≥2表示有差異，負值提示低水平

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2.3 不同臨床和病理學指標HCC患者血清let-7a和let-7b水平比較 有癌栓形成的HCC患者血清let-7a和let-7b水平顯著低于無癌栓形成患者（P＜0.05），但不同年齡、不同性別、血清AFP水平高低、腫瘤大小、不同細胞分化程度和TNM分期及有無腫瘤血管浸潤患者血清let-7a和let-7b水平無顯著性差異（P＞0.05，表5）。

表5 不同臨床和病理學指標HCC患者血清let-7a和 let-7b 水平（±s）比較

表5 不同臨床和病理學指標HCC患者血清let-7a和 let-7b 水平（±s）比較

與無癌栓形成者比，①P＜0.05

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2.4 不同臨床和病理學指標HCC患者癌組織let-7a和let-7b水平比較 不同年齡、性別、血清AFP水平、腫瘤大小、細胞分化、TNM分期和有無血管浸潤或癌栓形成的HCC患者癌組織let-7a和let-7b水平均無顯著性差異（P＞0.05，表6）。

表6 不同臨床和病理學指標HCC患者癌組織let-7a和 let-7b水平（±s）比較

表6 不同臨床和病理學指標HCC患者癌組織let-7a和 let-7b水平（±s）比較

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3 討論

改善肝癌患者的預后是目前臨床研究的重點，但現在仍缺乏能夠準確地預測患者預后的分子標志[8]。miRNA是一種能夠參與生物體發育、代謝、細胞凋亡的非編碼RNA分子。報道顯示miRNA更為穩定，經過各種環境變化仍能保持不變，可望成為可以應用的預測腫瘤患者預后的標志物[9,10]。let-7為發現較早的一種miRNA，其家族中共包含10名成員，其中let-7a是目前研究最多的一種miRNA。在對let-7家族的深入研究中發現，let-7在乳腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中組織均呈明顯低水平，let-7家族能夠與原癌基因 RAS、HMGA2和 C-myc的3'UTR結合，負調控靶標基因的表達，進而起到促進細胞調亡的作用[11，12]。國外[13，14]研究顯示，let-7 與腫瘤的發生發展高度相關，并能發揮抑癌基因的作用。在肺癌組織中let-7呈低水平狀態，且其低水平與肺癌術后患者生存期有關[15]。相關研究還指出，let-7a可以抑制肺癌和直腸癌等腫瘤的生長[16-18]。

本研究結果顯示，HCC患者血清 let-7a和let-7b水平明顯低于健康人（P＜0.05）；HCC患者肝癌組織let-7a和let-7b水平比癌旁組織呈明顯的下調趨勢，提示血清和癌組織let-7a和let-7b水平可能為HCC患者重要的血清分子生物學指標，對早期診斷HCC的疾病進展具有參考價值。單因素分析發現肝癌患者血清let-7a和let-7b水平與腫瘤患者門靜脈癌栓存在一定的關系。肝癌患者癌組織let-7a和let-7b相對水平與患者血清水平相一致,即癌組織let-7a和let-7b水平也降低。單因素分析結果還顯示，血清和組織let-7a和let-7b水平在不同年齡、不同性別、血清AFP水平高低、腫瘤大小、不同細胞分化程度和TNM分期及有無腫瘤血管浸潤患者無顯著性差異（P＞0.05），其結果還有待驗證。癌栓是一種出現于微循環、淋巴管和大小動靜脈的栓子。由于在腫瘤生長過程中，淋巴和血管受癌細胞侵犯，出現凝血功能異常和血流動力學障礙，還可導致血栓形成。本研究結果顯示，有癌栓形成的患者血清let-7a和let-7b水平降低，可能原因為低水平的let-7a和let-7b對腫瘤細胞的抑制作用減弱，使得惡性腫瘤細胞加速生長、侵襲和擴散，進而影響局部血流動力學，形成癌栓。國內外相關研究報道[19-22]顯示，let-7a水平與HCC患者腫瘤大小存在相關性，而本組血清let-7a和let-7b水平在不同腫瘤大小等各項臨床指標患者間無顯著差異，可能與本研究選擇的病例數、取樣時間和檢測方法的可靠性等因素有關，說明HCC患者血清let-7a水平還容易受到多種因素的干擾。

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