TNF-α和IL-1β通過MAPK通路上調人支氣管平滑肌細胞的緩激肽受體和內皮素受體

蔡 艷，楊旭東，雷 瑩

(1.西安交通大學第二附屬醫院藥學部，西安 710004；2.西安交通大學醫學部生物化學與分子生物學系，西安 710061；3.深圳華大生命科學研究院，深圳 518083)

氣道高反應性(AHR)是哮喘最重要的臨床特征之一，AHR的病理過程與慢性氣道炎癥密切相關[1-3]。炎性介質腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)在慢性呼吸道炎癥發生期間被合成和釋放，且在哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液中的水平增加[4]。研究發現，這2種細胞因子可促進哮喘中的氣道高反應性和氣道炎癥[5-6]。

緩激肽、內皮素-1和血栓素A2是重要的支氣管收縮物質。緩激肽對非哮喘患者的肺和支氣管無明顯作用，但對哮喘患者的支氣管有顯著收縮作用[7]。研究發現，與對照組相比，哮喘患者體內的內皮素-1和血栓素A2的水平顯著上調[8-10]。緩激肽和相關激肽，內皮素-1和血栓素A2分別作用于各自的G蛋白偶聯受體(GPCRs)緩激肽B1和B2受體、內皮素A型和B型受體以及血栓素A2受體，誘導支氣管收縮和引發炎性反應。

以往研究發現，TNF-α和IL-1β通過改變支氣管收縮物質的G蛋白偶聯受體的表達，參與誘導了氣道高反應性的發生。TNF-α和IL-1β通過激活離體小鼠氣管平滑肌細胞的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，上調緩激肽B1和B2受體介導的收縮以及受體的表達[11-12]。以往研究證明，通過給予哮喘模型大鼠TNF-α受體進行治療，可顯著降低內皮素A受體(ETA)和內皮素B受體(ETB)介導的氣道高反應性[13]。迄今為止，炎性細胞因子TNF-α和IL-1β與氣道收縮性物質如緩激肽、內皮素-1和血栓素A2在人氣道平滑肌細胞上的相互作用以及相關的信號調控通路仍不明確。本研究旨在探索TNF-α和IL-1β對人支氣管平滑肌細胞緩激肽B1和B2受體，內皮素ETB受體和血栓素A2受體的影響，并發現其潛在的細胞內MAPK信號轉導機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 T100熱循環儀，iQ5實時PCR檢測系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2試藥 TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-13，SP600125(1，9-吡唑烷酮)，SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)，U0126(1，4-二氨基-2，3-二氰基-1，4-雙-(2-氨基苯硫基)丁二烯)(美國Sigma公司)；LY294002(2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)(美國Cayman Chemical公司)；吡啶-6(美國Santa Cruz公司)；SMEM細胞培養基，聚-L-賴氨酸(美國ScienCell實驗室)；RNAfast1000總RNA提取試劑盒(中國先鋒生物技術有限公司)；cDNA逆轉錄合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.3細胞培養 人支氣管平滑肌細胞(HBSMCs)，購自美國ScienCell實驗室，將細胞在平滑肌細胞培養基(SMEM)中以5×103個活細胞/cm2的密度接種在聚-L-賴氨酸包被的細胞培養瓶中。當細胞超過90%融合時，將細胞傳代培養或移至24孔板中，在此階段添加細胞因子和抑制劑。

2 方法

2.1總RNA的提取和逆轉錄到cDNA 總RNA的提取和逆轉錄到cDNA使用RNAfast1000總RNA提取試劑盒提取總RNA。提取總RNA的質量和數量分別用260/280 nm和260/230 nm的紫外吸光度值比進行評估。所有RNA樣品均符合完整性標準，不含蛋白質、有機物和基因組DNA污染物(即260/280 nm處的吸光度值比為1.8～2.1，260/230 nm處的吸光度值比為1.65～1.8)。使用T100熱循環儀，用cDNA逆轉錄合成試劑盒在20 μL體積反應中進行總RNA向cDNA的逆轉錄。將RNA在65 ℃孵育5 min變性。變性后，將RNA立即在冰中冷卻至少1 min，并將反轉錄母體混合物加入管中。反轉錄反應在42 ℃進行1 h，70 ℃反應10 min，后將cDNA在-80 ℃保存直到進行實時定量PCR。

2.2實時聚合酶鏈反應(實時PCR) 實時聚合酶鏈反應(實時PCR)使用FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒在20 μL反應中，于iQ5實時PCR檢測系統上進行實時定量PCR反應，95 ℃加熱10 min，隨后在95 ℃變性20 s，退火溫度20 s，72 ℃延伸30 s，55～100 ℃的熔解曲線為記錄。見表1。由表1可知，研究中使用的所有PCR引物均使用Oligo 6.65軟件設計，并通過DNA技術合成。采用ΔΔCT方法計算受體mRNA的相對量。將管家基因β-actin的mRNA的CT值作為使受體的mRNA的相對量標準化的參考。通過相同樣品中β-actin mRNA的CT值與受體mRNA的CT值的比值獲得mRNA的相對量。

2.3總RNA的提取和逆轉錄 使用RNAfast1000總RNA提取試劑盒提取總RNA。總RNA的提取質量和數量分別用260/280 和260/230紫外吸光度值比進行評估。所有RNA樣品均符合完整性標準，不含蛋白質、有機物和基因組DNA污染物(即260/280吸光度值比為1.8～2.1，260/230吸光度值比為1.65～1.8)。使用T100熱循環儀，用cDNA逆轉錄合成試劑盒在20 μL體積反應中進行總RNA向cDNA的逆轉錄。RNA于65 ℃孵育5 min變性，之后置于冰中冷卻至少1 min，并將逆轉錄反應體系混合物按照建議比例加入管中。逆轉錄反應在42 ℃進行1 h，70 ℃反應10 min，然后將得到的cDNA產物于-80 ℃保存至進行實時定量PCR。

2.4實時聚合酶鏈反應(實時PCR) 使用FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒在20 μL反應中，于iQ5實時PCR檢測系統上進行實時定量PCR反應，95 ℃加熱10 min，隨后在95 ℃變性20 s，退火溫度20 s，72 ℃延伸30 s，記錄55～100 ℃的熔解曲線。由表1可知，所用引物信息，研究中使用的所有PCR引物均使用Oligo 6.65軟件設計，并通過DNA技術合成。采用ΔΔCT方法計算受體mRNA的相對量(相對量為相對于管家基因mRNA量的倍數)。將管家基因β-actin的mRNA的CT值作為參比值，計算受體mRNA的相對量。通過相同樣品中β-actin mRNA的CT值與受體mRNA的CT值的比值獲得mRNA的相對量。

表1引物信息

Tab.1 Primer information

基因名序列ID序列長度/bp退火溫度/℃β?actinNM＿001101．3F：5′?ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG?3′R：5′?AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG?3′17460B1RNM＿000710．3F：5′?ATATTCTGGGTTTCCTCCTAC?3′R：5′?GCTGTGGTCTTGCTATCC?3′12960B2RNM＿000623．3F：5′?AGGTGCTGCGGAACAACG?3′R：5′?GGAAGGTGCTGATCTGGAAGG?3′12860β2RNM＿000024．5F：5′?CCTATGGGAATGGCTACTC?3′R：5′?CCTTGTGAATCAATGTTATCG?3′16260ETBRNM＿000115．3F：5′?GCGAAACGGTCCCAATATC?3′R：5′?GCACATAGACTCAGCACAG?3′18560TXA2RNM＿001060．5F：5′?CCCTTCTGGTCTTCATCG?3′R：5′?CGGCGGAACAGGATATAC?3′15958

3 結果

3.1TNF-α上調HBSMCs中緩激肽B1和B2受體mRNA 將質量濃度為1，10和100 ng·mL-1的TNF-α加入HBSMCs培養體系中24 h，通過實時PCR測定緩激肽B1和B2受體、ETB受體、血栓素A2受體和β2腎上腺素受體的mRNA水平。見圖1。由圖1A可知，TNF-α增加了緩激肽B1和B2受體的mRNA水平，且這種效應具有濃度依賴性，而ETB受體、血栓素A2受體或β2腎上腺素受體的mRNA水平不受TNF-α的影響。為了評估TNF-α的效應-時間相關性，分別用質量濃度為10 ng·mL-1的TNF-α處理HBSMCs 3，6，12，24和48 h。由圖1B可知，在未刺激的HBSMCs中可檢測到低水平的緩激肽B1和B2受體mRNA。6 h時，TNF-α增加了緩激肽B1和B2受體的mRNA水平，這種mRNA水平的增加可隨著孵育時間延長至48 h。

3.2IL-1β上調HBSMCs中內皮素B受體mRNA 將質量濃度為1，10和 100 ng·mL-1的IL-1β加入HBSMCs培養體系中24 h，通過實時PCR測定緩激肽B1和B2受體、ETB受體、血栓素A2受體和β2腎上腺素受體的mRNA水平。見圖2。由圖2A可知，IL-1β增加了ETB受體的mRNA水平，這種效應具有濃度依賴性，而緩激肽B1和B2受體，血栓素A2受體或β2腎上腺素受體的mRNA水平不受IL-1β的影響。為了評估IL-1β的效應-時間相關性，將質量濃度為10 ng·mL-1的IL-1β加入HBSMCs培養體系中維持3，6，12，24和48 h。由圖2B可知，在未刺激的HBSMCs中可檢測到低水平的ETB受體mRNA。6 h時，IL-1β開始增加內皮素B受體mRNA水平，這種效應隨著孵育時間延長至48 h。

圖1TNF-α刺激后HBSMCs中G蛋白偶聯受體的mRNA

Fig.1 G-protein coupled receptors mRNA in HBSMCs when stimulated with TNF-α

圖2IL-1β刺激后HBSMCs中G蛋白偶聯受體的mRNA

Fig.2 G-protein coupled receptors mRNA in HBSMCs when stimulated with IL-1β

見圖3。由圖3可知，IL-6(質量濃度為1，10和100 ng·mL-1)和IL-13(質量濃度為0.5，5和50 ng·mL-1)分別與HBSMCs共同孵育24 h后，對緩激肽B1和B2受體、ETB受體、血栓素A2受體和β2腎上腺素受體的mRNA水平均無顯著影響。

3.3TNF-α通過p38和JNK通路上調緩激肽B1和B2受體mRNA 為了確認MAPK信號通路是否參與TNF-α對緩激肽B1和B2受體mRNA水平的上調作用，在質量濃度為10 ng·mL-1的TNF-α加入前1 h，將p38 MAPK抑制劑SB203580(10 μmol·L-1)、c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制劑SP600125(10 μmol·L-1)、MAPK/ERK激酶(MEK1/2)抑制劑U0126(10 μmol·L-1)、NF-κB通路IκB激酶(IKK)抑制劑TPCA-1(10 μmol·L-1)和相應的空白溶劑加入到HBSMCs培養液中，分別與HBSMCs共同孵育24 h后，測試緩激肽B1和B2受體的mRNA水平變化，見圖4。由圖4A和4B可知，SB203580和SP600125降低了由TNF-α上調的緩激肽B1和B2受體mRNA水平，而U0126和TPCA-1未有明顯作用。

圖3IL-6和IL-13刺激后HBSMCs中G蛋白偶聯受體的mRNA

Fig.3 G-protein coupled receptors mRNA in HBSMCs when stimulated with IL-6 and IL-13

已報道Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK/STAT)通路和Ⅰ類磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路參與調節TNF-α介導的細胞增殖。為了研究這些信號通路是否也參與調節緩激肽B1和B2受體mRNA水平，在質量濃度為10 ng·mL-1的TNF-α加入前1 h加入泛JAK抑制劑吡啶-6(10 μmol·L-1)和PI3K抑制劑LY294002(10 μmol·L-1)至HBSMCs培養體系中。由圖4A和4B可知，它們都不影響緩激肽B1和B2受體的mRNA水平。

3.4IL-1β通過MEK1/2和下游IκB激酶上調內皮素B受體Mrna 為了研究 MAPK信號通路是否參與IL-1β對ETB受體mRNA水平的上調作用，在質量濃度為10 ng·mL-1的IL-1β加入前1 h，向HBSMCs培養體系中分別加入p38 MAPK抑制劑SB203580(10 μmol·L-1)，JNK抑制劑SP600125(10 μmol·L-1)，MEK1/2抑制劑U0126(10 μmol·L-1)和IκB激酶抑制劑TPCA-1(10 μmol·L-1)或空白溶劑。由圖4C可知，10 (〗μmol·L-1)〗的U0126和TPCA-1幾乎消除了IL-1β對ETB受體mRNA水平的上調作用，而SB203580和SP600125無顯著影響。

圖4MAPK與NF-κB通路參與上調TNF-α和IL-1β誘導的緩激肽受體和內皮素受體mRNA

Fig.4 MAPK and NF-κB pathways were involved in TNF-αand IL-1βinduced upregulation of bradykinin receptors and endothelin receptor mRNA

本實驗還研究了pan-JAK抑制劑吡啶-6(10 μmol·L-1)和PI3K抑制劑LY294002(10 μmol·L-1)是否參與IL-1β對HBSMCs中ETB受體mRNA水平的調節作用。由圖4C可知，它們均不影響ETB受體mRNA的水平。

4 討論

已有研究提出，促炎性細胞因子TNF-α和IL-1β在免疫反應和變應性哮喘炎癥發展中發揮著重要作用[14]。之前的研究發現，抗TNF-α抗體英夫利昔單抗降低了過敏性哮喘模型大鼠支氣管收縮反應，并減少了肺部的炎癥反應[13]。本研究中，我們觀察了炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β與幾種重要的支氣管收縮劑(如緩激肽、血栓素A2和內皮素-1)之間的相互作用。實驗發現，TNF-α上調了緩激肽B1和B2受體mRNA，IL-1β上調了人支氣管平滑肌細胞中的ETB受體mRNA。P38MAPK抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125、ERK1/2抑制劑U0126和IκB激酶抑制劑TPCA-1的干預實驗顯示MAPK通路參與這些上調機制。

哮喘患者對激肽類物質表現出高反應性[15]，且與正常人相比，過敏性呼吸道炎癥受試者的氣道中緩激肽B1和B2受體表達上調[16-17]。以往在小鼠氣管上的研究發現，緩激肽B1和B2受體都被TNF-α誘導上調[12]，本研究結果與這一發現相符，TNF-α同樣誘導人支氣管平滑肌細胞的緩激肽B1和B2受體mRNA上調。研究發現，人支氣管平滑肌細胞在加入TNF-α后截至48 h，緩激肽B1和B2受體mRNA隨著時間的延長而增加。其他小組對原代人氣管平滑肌細胞的研究發現，TNF-α增加了緩激肽誘導的胞質游離Ca2+濃度上調，且需要至少6 h的刺激才可完成對Ca2+的動員[16]，這一發現解釋了本研究中緩激肽B1和B2受體mRNA上調的起始時間為6 h。綜上所述，TNF-α可能通過增加氣道平滑肌表面緩激肽受體的表達來上調過敏性呼吸道炎癥患者對體內緩激肽的反應。

IL-1β是哮喘氣道平滑肌高反應性的關鍵調節因子[19]。之前在小鼠氣管中的研究表明，IL-1β降低了ETB受體介導的收縮反應，且氣管平滑肌中ETB受體mRNA被下調[20]。本研究顯示，IL-1β上調了人支氣管平滑肌細胞ETB受體mRNA。在離體人支氣管中，ETB受體分布于呼吸道平滑肌細胞并介導收縮反應，而ETA受體存在于呼吸道上皮細胞中，介導一氧化氮的釋放，抵消收縮效應[21]。與之不同的，小鼠氣管平滑肌中可同時檢測到ETA和ETB受體的功能和mRNA，且2種類型的受體均介導收縮反應[20]。因此，人和小鼠呼吸道之間ETA和ETB受體的不同分布和功能可能是IL-1β對小鼠和人氣道平滑肌細胞的不同作用的一個解釋。

MAPK信號通路可誘導核因子κB(NF-κB)等轉錄因子，并參與受體的轉錄。以往研究表明，MAPK信號通路和下游NF-κB的激活可導致小鼠氣道平滑肌細胞中G蛋白偶聯受體的改變[22-23]。JNK抑制劑SP600125降低了TNF-α對體外培養的小鼠氣管緩激肽B1和B2受體mRNA的上調[20]。本研究中，SB203580和SP600125降低了TNF-α誘導的HBSMCs中緩激肽B1和B2受體mRNA的上調，表明JNK和P38 MAPK途徑參與了該過程。因此，TNF-α和緩激肽之間的相互作用，很可能在人和小鼠氣道平滑肌細胞中經由類似的細胞內信號機制發生。以往研究證實，MEK1/2信號通路參與調解大氣污染顆粒物對大鼠支氣管平滑肌ETB受體的上調作用[24]。在本研究中，MEK抑制劑U0126和IκB激酶抑制劑TPCA-1，顯著降低IL-1β上調的人氣道平滑肌細胞中ETB受體mRNA。因此，本研究為MEK1/2在呼吸道炎癥中調節ETB受體的表達提供了更多的證據。

綜上所述，研究發現TNF-α上調HBSMCS中緩激肽B1和B2受體mRNA，IL-1β上調HBSMCS中內皮素ETB受體mRNA。P38 MAPK抑制劑SB203580和JNK MAPK抑制劑SP600125顯著降低TNF-α上調的緩激肽B1和B2受體mRNA，MEK1/2抑制劑U0126和IκB激酶抑制劑TPCA-1顯著降低IL-1β上調的ETB受體mRNA。本研究為炎性細胞因子誘導的支氣管高反應性的發生機制提供了進一步的證據。

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