高麗槐素的細胞毒性作用及其相關機制研究

陳 露，趙 靜，梁麗薇，高曉黎*

(新疆醫科大學藥學院藥劑教研室，烏魯木齊 830011)

高麗槐素(maackiain, 1.6α,12α-dihydro-6H-(1,3) dioxolo (5,6) benzofuro (3,2-c)(1) benzopyran-3-ol)又名馬卡因,化學結構見圖1。高麗槐素廣泛存在于紅車軸草[1]、牛大力[2]、錦雞兒[3]和苜蓿等植物中，其中苜蓿和紅車軸草是新疆常見的植物，多分布在草原或綠洲地帶，全國均有分布[4]。通過對文獻的收集整理發現，高麗槐素具有抗腫瘤活性[5]，抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和谷草芽孢桿菌[6]的分裂生長以及鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2(SGLT-2)活性[7]。同時該物質對雌激素受體無明顯活性，對脂代謝誘導的一氧化氮生成具有抑制作用和強效殺菌作用[8]。高麗槐素的現有研究結果表明，它具有抗菌、抗癌活性[9]以及芳香基抑制等作用；同時也有殺幼蟲作用[10]，能夠殺蟲，但對體外安全性的相關研究缺乏有力根據[11]。本文擬從細胞水平探討高麗槐素對心、肝、腎等細胞的增殖[12]、凋亡[13]和活性影響[14]。

圖1高麗槐素的化學結構

Fig.1 The chemical structure of maackiain

1 儀器與材料

1.1儀器 Milli-Q Academic超純水儀(Millipore公司)；冷凍離心機(法國Jouan公司)；二氧化碳培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)；Sartorius BAS220天平(德國賽多利斯集團)；酶標儀(Perkin Elmer公司)；DK-S22型水浴鍋(上海精科公司)；低溫冰箱(海爾公司)；熒光倒置顯微鏡(Zeiss公司)；紫外可見分光光度計(日本島津公司)等。

1.2試藥 高麗槐素(成都曼思特生物科技有限公司，質量分數>98%)；DMEM培養基(高糖)，PBS緩沖液，胰蛋白酶，優級牛血清(Hyclone公司)；噻唑藍(MTT，廣州賽國生物科技有限責任公司)；HOE33342染色試劑(南京凱基生物科技發展有限公司)；TUNEL凋亡試劑盒(Roche公司)；LDH、AST、ALT和CK試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.3細胞 H9C2(新疆醫科大學第一附屬醫院提供)；VSMC和HEK293細胞(國家藥物篩選中心提供)；L-02細胞(新疆華世丹藥物有限公司提供)。

2 方法

2.1細胞培養 H9C2、L-02、HEK293和VSMC細胞培養在胎牛血清(FBS)，加有100 u·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養基中，置于恒溫箱中培養，顯微鏡下觀察并根據生長情況換液，取對數生長期且達到目標數量的細胞進行實驗[15]。

2.2MTT法 將處于對數生長期的細胞觀察計數，每毫升4×104個細胞，若計數超出即稀釋至該細胞密度，在96孔板中接種90 μL細胞液。37 ℃孵育24 h后，分別加入不同濃度的高麗槐素溶液(0.1,1,5,10,50,100,200,250和300 μmol·L-1)。相同孵育條件下每組6復孔，每孔10 μL，正常細胞為對照組。72 h后，取出96孔板吸去上清培養液。每孔加入質量濃度為0.5 mg·mL-1的 MTT溶液100 μL，4 h后棄液，加入100 μL二甲基亞砜(DSMO)，緩慢振搖，15 min后在570 nm波長處用酶標儀檢測各孔吸光度值A[16]，抑制率= (1-給藥組A值/對照組A值)×100%。

2.3HOE33342熒光細胞核染色法 將4種細胞處于對數生長期時接種于96孔板，相同環境下孵育24 h后，分別給予高麗槐素低(1 μmol·L-1)、中(50 μmol·L-1)和高濃度(300 μmol·L-1)。置于37 ℃的CO2恒溫培養箱中孵育培養。每組6復孔，完全培養基作為對照組，每孔10 μL。72 h后棄液再加入加多聚甲醛溶液，固定15 min后棄液并用HOE33342試劑染色15 min，固定，觀察細胞凋亡情況[17]。

2.4TUNEL法檢測細胞凋亡 將處于對數生長期的細胞H9C2、L-02、HEK293和VSMC，以2×104個·mL-1接種于12孔板中，每孔2 mL細胞懸浮液。在37 ℃孵育24 h后，分別給予低、中、高濃度(1，50和300 μmol·L-1)的高麗槐素，方法嚴格按照TUNEL試劑盒說明書。分別加入反應混合液，濕盒內孵育，1 h后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min；再加50 μL 過氧化物酶 (POD) 培養，孵育60 min后取出，同樣用PBS緩沖液沖洗；再加入50 μL的二氨基聯苯胺(新配制)3～5 min，觀察細胞凋亡情況[18]，凋亡率為染色呈陽性細胞數與總細胞數的比值，用百分比表示。

2.5高麗槐素對細胞酶活性的影響 細胞處于對數生長期時，將每毫升4×104個細胞數的懸浮液接種于96孔板90 μL，37 ℃孵育，24 h后給予低、中和高濃度(1，50和300 μmol·L-1)的高麗槐素。將無高麗槐素作為空白對照組，72 h后，棄去上清液，按照LDH、ALT、AST和CK的試劑盒說明書，根據參考文獻方法，檢測酶活性[19-20]。

3 結果

3.1高麗槐素對細胞增殖的影響 濃度范圍在0.1～300 μmol·L-1的高麗槐素作用4種細胞72 h后，細胞增殖率結果表明：(1)0.1～300 μmol·L-1時可促使大鼠心肌細胞H9C2增殖(P<0.05)，且在0.1～100 μmol·L-1時H9C2細胞增殖明顯(P<0.01)；(2)0.1～5 μmol·L-1時，高麗槐素對人胚肝細胞L-02差異無統計學意義，10～300 μmol·L-1時，L-02細胞增殖明顯(P<0.01)；(3)0.1～5 μmol·L-1時，對HEK293細胞無抑制作用；但濃度在10～300 μmol·L-1時，具有抑制作用(P<0.05)，同時表現劑量依賴性；(4)0.1～300 μmol·L-1時高麗槐素對VSMC細胞有抑制，且作用顯著(P<0.01)，但不呈現趨勢性，結果表明，在濃度為200 μmol·L-1時，細胞抑制影響較大。見圖2。

圖2高麗槐素對細胞的增殖作用

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01，n=6。

Fig.2 The effects of maackiain on cell proliferation

Note：compared with the control group*P<0.05，**P<0.01，n=6.

3.2HOE33342熒光細胞核染色法檢測細胞在高麗槐素作用下的凋亡情況 檢測細胞凋亡，結果通過熒光倒置顯微鏡觀察，濃度為1，50和300 μmol·L-1高麗槐素作用后的H9C2 和L-02細胞的細胞核完整，凋亡現象較少；濃度為50和300 μmol·L-1高麗槐素與HEK293細胞作用后，與空白對照組細胞比較，出現凋亡小體。結果表明，高麗槐素在50 μmol·L-1以上濃度條件下會促進HEK293細胞凋亡。在1～300 μmol·L-1時，VSMC細胞均出現凋亡情況，對該細胞有影響。見圖3。

3.3TUNEL法檢測高麗槐素對細胞凋亡的影響 高麗槐素在各濃度組下(1，50和300 μmol·L-1)H9C2和L-02細胞經觀察細胞核完整、無明顯的皺縮現象，細胞凋亡率結果顯示差異無統計學意義(P>0.05)。同時高麗槐素濃度50和300 μmol·L-1與HEK293和VSMC細胞作用下，與空白對照組細胞相比，染色質濃縮，細胞核縮小有碎裂現象，出現凋亡小體，細胞凋亡且凋亡率降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖4和圖5。

圖3高麗槐素作用下的細胞凋亡情況(HOE33342，×20)

Fig.3 The effects of maackiain on cell apoptosis (HOE33342，×20)

圖4高麗槐素作用下的細胞凋亡情況顯微圖(TUNEL，×20)

Fig.4 Micrograph of the effects of maackiain on cell apoptosis (TUNEL，×20).

圖5高麗槐素對細胞的凋亡作用

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01，n=6。

Fig.5 The effects of maackiain on cell apoptosis

Note：compared with the control group*P<0.05，**P<0.01，n=6.

3.4高麗槐素對LDH的影響 細胞H9C2、L-02在高麗槐素1，50和300 μmol·L-1濃度下，乳酸脫氫酶(LDH)的活性變化差異無統計學意義(P>0.05)。高麗槐素濃度在50和300 μmol·L-1時，HEK293和VSMC細胞與空白對照組比較，細胞上清液隨濃度的增大LDH活性提高(P<0.05)。見圖6。

圖6高麗槐素對LDH的影響

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01，n=3。

Fig.6 The effects of maackiain on LDH in cell culture medium

Note：compared with the control group*P<0.05，**P<0.01，n=3.

3.5高麗槐素對ALT、AST和CK的影響 與對照組比較，高麗槐素濃度在1，50和300 μmol·L-1時H9C2細胞酶活性(AST和CK)差異無統計學意義(P>0.05)；L-02細胞對ALT差異無統計學意義(P>0.05)，在1，50和300 μmol·L-1濃度組中，濃度為50 μmol·L-1時AST活性顯著降低(P<0.05)，其余2組差異無統計學意義。見圖7。

圖7高麗槐素對細胞培養液中AST、ALT和CK的影響

注：與對照組比較*P<0.05，n=3。

Fig.7 The effects of maackiain on AST，ALT and CK in cell culture medium

Note：compared with the control group*P<0.05，n=3.

4 討論

高麗槐素是異黃酮類化合物，與細胞的增殖及凋亡情況有關，根據各細胞的自身細胞形態以及采用方法，結果可能呈現不同特點。本實驗選用4種正常細胞進行考察，初步研究高麗槐素的體外安全性，進一步預測心肌、肝、腎和血管平滑肌功能的作用。

體外細胞毒性通常是考察受試藥物對細胞增殖、凋亡以及經酶作用后的影響，MTT法檢測高麗槐素對細胞生長是否具有抑制作用，可以初步判斷藥物對正常細胞的影響。通過實驗可看出高麗槐素在一定濃度下對HEK293和VSMC細胞有抑制作用；驗證高麗槐素對H9C2、L-02、HEK293和VSMC 4種細胞核形態及凋亡的影響，結果顯示，對L-02和H9C2細胞無影響，對HEK293和VSMC細胞在高濃度條件下有抑制作用，與MTT法結果基本相符；在考察了高麗槐素對細胞增殖和凋亡的基礎上，用酶活性進一步考察與細胞膜是否完整的相關性。

綜上所述，通過高麗槐素在體外對4種細胞的毒性作用考察，不難看出，高麗槐素對心肌細胞和肝細胞的生長抑制作用無影響，證明了該物質在實驗濃度范圍內體外無毒性作用；同時人胚腎細胞和血管平滑肌細胞在實驗高劑量組呈現細胞抑制和凋亡現象，說明該物質在高麗槐素濃度高時有一定毒性作用。首次對高麗槐素的體外安全性初步研究提供了參考，為具有該物質活性成分的藥物早期開發提供了理論依據。

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