聚蘋果酸-阿霉素/多烯紫杉醇納米共聚物的制備及性質研究

余 喆，周 青，喬友備，郭松巖，張 雨，吳 紅

(空軍軍醫大學藥學院藥物分析學教研室，西安 710032)

化療是治療癌癥的重要手段之一[1]，化療藥物通常為小分子藥物，難溶于水，生物利用度較低，尤其是非特異性毒性及多藥耐藥性等限制了其發展[2]。聚合物載體材料用于藥物的輸送可實現高效低毒地治療腫瘤[3-4]，藥物通過共價鍵與聚合物連接形成納米共聚物，可改善藥物水溶性并靶向腫瘤部位給藥，減少藥物在正常組織的蓄積。常用的聚合物載體主要有聚氨基酸類、聚酯類和多糖等，其中聚酯類是應用最廣泛的載體材料，包括聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)和聚己內酯(PCL)等，它們不溶于水，且可修飾基團有限，僅有端基可供修飾，難以滿足藥物載體多功能修飾的要求。聚蘋果酸[poly (β-malic acid)，PMLA]是一種新型的脂肪族聚酯，在體內可生物降解，水溶性好，且有許多懸掛羧基可供修飾，是一種優于多糖和多肽類生物高分子的新型藥物載體。但PMLA作為藥物載體研究還處于起步階段，鮮見其他以PMLA為藥物載體的研究報道。

阿霉素(doxorubicin，DOX)與多烯紫杉醇(docetaxel，DTX)是臨床常見的化療小分子藥物，是治療乳腺癌的一線用藥[5-7]。DOX能干擾DNA合成期堿基對的配對，使S期細胞比例提高[8]；DTX為紫杉烷類藥物，主要抑制細胞分裂期，使細胞停滯在G2/M期，兩藥聯用產生序貫協同作用。阿霉素的分子結構具有活性氨基，較易被聚合物通過共價鍵相連修飾成DOX前藥且保留了DOX的抗腫瘤活性[9]。早期研究表明，DTX的2′位C上所連羥基酰基化取代具有更好的抗腫瘤效果，且2′位C的單羥基取代比多羥基取代在生理條件下更易水解[10-11]。因此，本研究利用PMLA作為載體，采用“一鍋煮”法同時將DOX與DTX分別以酰胺鍵和酯鍵與PMLA連接，考察納米共聚物與游離藥物的細胞內攝作用及對腫瘤細胞的抑制作用，研究2種藥物的協同抗腫瘤作用。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Advance DMX500核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；THZ-C-1全溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)；1260 Inifity Ⅱ高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；LGJ-10冷凍干燥機(美國SIM公司)；BIO-RAD 680酶聯免疫檢測儀(美國伯樂公司)；Tecnai Spirit 100KV透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；DelsaTMNano C動態光散射粒度分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司)。

1.2試藥 三氟乙酸酐(濟南萬興達化工廠)；N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，均購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；鹽酸阿霉素(DOX·HCl)和多烯紫杉醇(DTX)，均購自北京華奉聯博化學材料有限公司；透析袋購自科昊生物工程有限公司；人肝臟組織蛋白酶B與豬肝酯酶均購自美國西格瑪奧德里奇公司；細胞毒性活性試劑檢測盒CCK-8與4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自英國賽默飛世爾公司；人乳腺癌細胞MDA-MB-231購自上海細胞庫；其他化學試劑均由天津市富宇精細化工有限公司提供。

2 方法與結果

2.1PMLA-DOX/DTX的制備 采用課題組建立的方法合成載體PMLA[12-15]，以L-天冬氨酸為原料，通過氨基重氮化、酯化和陰離子開環聚合反應，最后氫化得PMLA。得到的PMLA透析除去小相對分子質量的聚合物，冷凍干燥待用。取116 mg干燥的PMLA(相對分子質量9 kDa，含-COOH 1 mmol)、172.6 mg NHS(1.5 mmol)、191.7 mg EDC·HCl(1 mmol)和122.17 mg DMAP(1 mmol)溶于無水二甲基亞砜(DMSO)，抽真空反應2 h。DOX·HCl與三乙胺(TEA)反應過夜，得到游離DOX。同時將游離DOX(0.5 mmol)與DTX(0.5 mmol)加入PMLA反應液，真空通N2保護，避光反應24 h，透析凍干得180 mg PMLA-DOX/DTX，合成路線見圖1。

圖1PMLA-DOX/DTX的合成路線

Fig.1 The synthesis route of PMLA-DOX/DTX

2.2PMLA-DOX/DTX的結構表征 取10 mg PMLA-DOX/DTX溶于氘代DMSO，核磁共振氫譜(1H-NMR)結果見圖2。2.95～3.02為主鏈上亞甲基質子峰，5.39～5.41為主鏈上次甲基質子峰。共聚物在7.0～8.0出現的苯環質子峰來自藥物，證實兩藥共價連接于載體。

圖2PMLA-DOX/DTX的核磁共振氫譜

Fig.2 The1H-NMR spectroscopy of PMLA-DOX/DTX

2.3載藥率的測定 各取10 mg PMLA-DOX/DTX溶于透析袋內，分別置于100 mL pH值為7.4與pH值為5.0 的PBS緩沖液中，模擬體內環境，在pH值為7.4的緩沖液中加入豬肝酯酶(0.25 U)，pH值為5.0的緩沖液中加入組織蛋白酶B(300 U)，37 ℃，100 r·min-1攪拌。1 h后每隔一段時間吸取上述緩沖液各20 μL，直至對應游離藥物的高效液相色譜峰峰面積不再增加，計算其藥物含量。DOX的色譜條件：十二烷基硫酸鈉溶液(取十二烷基硫酸鈉1.44 g和磷酸0.68 mL，加水500 mL使溶解)∶乙腈∶甲醇=500∶500∶60；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm。DTX的色譜條件：流動相：乙腈∶水=45∶55；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：227 nm。精密稱取10 mg DOX和DTX分別溶于10 mL流動相中，配置成質量濃度為1 mg·mL-1的母液，根據母液準確稀釋至100，75，50，25和10 μg·mL-1的梯度質量濃度的DOX和DTX系列標準溶液。濾膜過濾后，取20 μL進樣記錄不同質量濃度峰面積，計算其標準曲線的回歸方程。根據此標準曲線計算緩沖液中游離藥物的質量濃度。見圖3。由圖3可知，分別按照兩藥的標準曲線計算，按照共聚物中藥物的載藥率計算：

載藥率(%)=m藥物÷(m藥物+m聚合物)，得DOX的載藥率為21.5%±1.2%，DTX的載藥率為11.03%±1.51%。

圖3DOX(A)與DTX(B)的高效液相圖譜及對應標準曲線

Fig.3 The HPLC chromatograms and the standard curve of DOX and DTX

2.4PMLA-DOX/DTX膠束的制備 稱取不同質量的PMLA-DOX/DTX溶于去離子水中(終質量濃度為2，1，0.5，0.1和0.05 mg·mL-1)，攪勻，各取1 mL，緩慢滴入20 mL DMSO，攪拌4 h，再移至相對分子質量為7 kDa的透析袋中，用去離子水透析24 h，37 ℃下放置2 h，動態光散射粒度分析儀測其水合粒徑。通過透射電子顯微鏡，觀察其形態與表面特征。不同質量濃度的聚合物制備膠束時，質量濃度為1 mg·mL-1的聚合物所制得的膠束均一性更好，粒徑在150 nm左右，多分散性指數為0.14，見圖4。

圖4PMLA-DOX/DTX膠束的粒徑與透射電鏡圖

Fig.4 The particle size and transmission electron microscope image of micelle

2.5體外釋藥 稱取10 mg PMLA-DOX/DTX溶于透析袋內，分別以50 mL pH值為5.0和7.4的緩沖液為釋放介質，在透析袋內加入300 U的組織蛋白酶B與0.25 U的豬肝酯酶，37 ℃，100 r·min-1攪拌。分別在1，2，4，6，8，10，12，24，36，48 和72 h取出200 μL，同時補進同體積的相應緩沖溶液。用HPLC分別在波長254與227 nm處測定，計算DOX與DTX的質量濃度。共聚物體外釋藥曲線見圖5，由于酯鍵的水解較酰胺鍵的水解速度更快，DTX的釋放速率較快。在釋放前4 h內，pH值為7.4的緩沖液中DOX與DTX的釋放率分別為8.5%與17.6%，而此后DOX的釋放速率逐漸降低，DTX一直保持較DOX快的釋放速率。上述釋放特點能在早期實現兩藥的序貫釋放和對腫瘤細胞的快速殺傷作用。

圖5PMLA-DOX/DTX在37℃PBS緩沖液中累積釋藥曲線

Fig.5 Theinvitroaccumulate release profile of PMLA-DOX/DTX in PBS buffer at 37 ℃

2.6細胞毒性研究 將對數生長期的乳腺癌細胞 MDA-MB-231接種到96 孔板中，每孔1×104個，置于37 ℃、體積分數為5%的CO2孵育箱中培養。待細胞長至80%，棄去原有培基，給藥總質量濃度為1.5 μg·mL-1，檢測兩藥(DOX/DTX)在不同摩爾比(20∶1，10∶1，2∶1，1∶1，5∶1，1∶2，1∶7)時的細胞活性。每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養4 h，用酶聯免疫檢測儀測定各孔的吸光度值A，測定波長為490 nm，計算細胞的存活率。細胞存活率計算公式：

見圖6。由圖6 B可知，兩藥(DOX/DTX)摩爾比為10∶1時，對MDA-MB-231細胞的協同效果最好。加入同摩爾比的PMLA-DOX/DTX(1，5，10，20和40 μg·mL-1)處理細胞48 h，各質量濃度設5個復孔，并設空白對照組計算半數抑制質量濃度(IC50)。由圖6 A可知，PMLA-DOX/DTX的IC50為9.21 μg·mL-1。

2.7細胞內攝作用 將對數生長期的乳腺癌MDA-MB-231細胞接種至激光共聚焦培養皿，使細胞懸浮液中細胞數為每毫升1×104個，鋪板完成后，置于37 ℃孵箱中培育24 h，待細胞貼壁后，棄去舊培養液，加入含藥培養基(DOX質量濃度為1.3 μg·mL-1)，繼續培養4 h使細胞充分攝取藥物，固定染色，激光共聚焦觀察藥物入胞。用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞對不同藥物的攝取，見圖7。由圖7可知(紅色為DOX，藍色為細胞核染料DAPI)，4 h后所有樣品中均有DOX入細胞核。其中PMLA-DOX/DTX的阿霉素熒光強度最高，說明該組藥物入胞最多。

圖6共聚物PMLA-DOX/DTX的細胞毒實驗

A.細胞生長抑制曲線；B.2種藥物不同比例對MDA-MB-231細胞的毒性作用。*P<0.05，**P<0.01。

Fig.6 The cytotoxicity of PMLA-DOX/DTX in MDA-MB-231

A.the growth-inhibitory curve of PMLA-DOX/DTX；B.the influence of different drug ratios on the cytotoxicity to MDA-MB-231 cells.*P<0.05,**P<0.01.

圖7激光共聚焦觀察PMLA-DOX/DTX的入胞(比例尺為50μm)

A.游離藥物DOX；B.PMLA-DOX；C.PMLA-DOX/DTX在37 ℃與MDA-MB-231細胞共孵育4 h。

Fig.7 Cell internalization of PMLA-DOX/DTX observed by confocal laser scanning microscopy (scale bar was 50 μm)

A.free DOX；B.PMLA-DOX；C.PMLA-DOX/DTX incubated with MDA-MB-231 cell for 4 h under 37 ℃.

3 討論

本實驗選用PMLA作為載體，以“一鍋煮”法分別通過酰胺鍵與酯鍵連接DOX與DTX。DOX和DTX載藥率分別為21.5%±1.2%和11.03%±1.51%。進一步考察2種藥物體外釋藥，組織蛋白酶B[16]是一種在腫瘤組織中高表達的水解酶，弱酸性環境中易被活化，可促進DOX在酸性環境中的釋放。因此，DOX在組織蛋白酶B催化作用后，在pH值為5.0的釋放率增加，且釋放表現酸依賴性。相反，豬肝酯酶在pH值為7.4比pH值為5.0時活性更高，因而DTX在中性條件比酸性條件釋放更多。此法合成步驟簡單，具有載藥率高、減少藥物泄露等優點。Ma Y等[17]利用殼聚糖為載體，制備了2種藥物共載的聚合物膠束，先用酸敏鍵連接DOX，再與普朗尼克F127形成膠束物理包封紫杉醇。結果表明，多步反應的載藥率最高僅為15.94%(阿霉素)與9.01%(紫杉醇)，且2種藥物的體外釋藥無明顯的酸依賴性。聚合物藥物共聚物透析法制備膠束，形成的納米粒為規整均一的球形，粒徑為150 nm，多分散性指數為0.14。根據多個納米研究團隊對納米粒粒徑的研究[18-20]，納米粒(≥100 nm)具有長循環特性，納米粒(≤50 nm)具有強的腫瘤組織穿透及滲透能力。說明納米共聚物制備成膠束具備體內長循環特性，并可通過腫瘤富集與滲透效應實現在腫瘤組織中的高效富集。因此，PMLA作為載體材料既可多功能修飾也可制備成合適粒徑大小的納米粒。細胞抑制實驗和細胞攝取實驗中聚合物藥物共聚物對MDA-MB-231細胞的抑制率和入胞明顯優于游離藥物組，這是因為聚合物藥物共聚物改變了藥物入胞的方式，促進了藥物入胞，提高了藥物的細胞毒性。

綜上所述，這種以聚合物載體連接多種藥物協同殺傷腫瘤細胞的方式，既改善了藥物的水溶性，也有助于減少游離藥物的用量。本研究為構建基于PMLA的聯合遞藥體系奠定了重要基礎。

參考文獻：

[1] Devita V T Jr,Young R C,Can ellas G P.Combination versus single agent chemotherapy：a review of the basis for selection of drug treatment of cancer[J].Cancer，1975，35(1):98-110.

[2] R Jahanban-Esfahlan，K Seidi，Banimohamad-shotorbani B,et al.Combination of nanotechnology with vascular targeting agents for effective cancer therapy[J].J Cell Physiol，2018，233(4):2982-2992.

[3] Ljubimova J Y，Sun T，Mashouf L，et al.Covalent nano delivery systems for selective imaging and treatment of brain tumors[J].Adv Drug Deliv Rev，2017，113:177-200.

[4] Du C，Qian J，Zhou L，et al.Biopolymer-drug conjugate nanotheranostics for multimodal imaging-guided synergistic cancer photothermal-chemotherapy[J].ACS Appl Mater Interfaces，2017，9(37):31576-31588.

[5] Jacobs C，Clemons M，Mazzarello S，et al.Enhancing accrual to chemotherapy trials for patients with early stage triple-negative breast cancer：a survey of physicians and patients[J].Support Care Cancer，2017，(25):1881-1886.

[6] Mavroudis D，Saloustros E，Boukovinas I，et al.Sequential vs concurrent epirubicin and docetaxel as adjuvant chemotherapy for high-risk, node-negative, early breast cancer：an interim analysis of a randomised phase III study from the Hellenic Oncology Research Group[J].Br J Cancer，2017，117(2):164-170.

[7] Joensuu H，Kellokumpu-Lehtinen P L，Huovinen R，et al.Adjuvant Capecitabine in Combination With Docetaxel，Epirubicin，and Cyclophosphamide for Early Breast Cancer:The Randomized Clinical FinXX Trial[J].JAMA Oncol，2017，3(6):793-800.

[8] Bao Y，Yin M，Hu X，et al.A safe，simple and efficient doxorubicin prodrug hybrid micelle for overcoming tumor multidrug resistance and targeting delivery[J].Journal of Controlled Release，2016，235:182-194.

[9] Khandare J，Minko T.Polymer-drug conjugates：Progress in polymeric prodrugs[J].Progress in Polymer Science，2006，31(4):359-397.

[10]Pendri A，Conover C D，Greenwald R B.Antitumor activity of paclitaxel-2′-glycinate conjugated to poly(ethylene glycol)：a water-soluble prodrug[J].Anticancer Drug Des，1998，13(5):387-395.

[11]Huynh L，Leroux J，Allen C.Enhancement of docetaxel solubility via conjugation of formulation-compatible moieties[J].Organic & Biomolecular Chemistry，2009，7(17):3437.

[12]Sandrine Cammas，Isabelle Renard，Valerie Langlois，et al.Poly(β-malic acid)：obtaining high molecular weights by improvement of the synthesis route[J].Polymer，1996，37(18):4215-4220.

[13]Qiao Y，Duan X，Fan L，et al.Synthesis of controlled molecular weight poly (β-malic acid) and conjugation with HCPT as a polymeric drug carrier[J].Journal of Polymer Research，2014，21(4)：397.

[14]郭松巖，崔明鳳，周青，等.PMLA-PEG-TAT 納米接枝物的合成和生物活性研究[J].西北藥學雜志，2015，30(2)：176-181.

[15]李偉，段曉，范黎，等.葉酸介導的聚乙二醇-聚蘋果酸-喜樹堿聚合物前藥的制備和性質初探[J].西北藥學雜志，2013，28(4)：396-399.

[16]Kurtoglu Y E，Mishra M K，Kannan S，et al.Drug release characteristics of PAMAM dendrimer-drug conjugates with different linkers[J].International Journal of Pharmaceutics，2010，384(1/2):189-194.

[17]Ma Y，Fan X，Li L.pH-sensitive polymeric micelles formed by doxorubicin conjugated prodrugs for co-delivery of doxorubicin and paclitaxel[J].Carbohydr Polym，2016，137:19-29.

[18]Tang L，Yang X，Yin Q，et al.Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111(43):15344-15349.

[19]Hoshyar N，Gray S，Han H，et al.The effect of nanoparticle size oninvivopharmacokinetics and cellular interaction[J].Nanomedicine (Lond)，2016，11(6):673-692.

[20]Tang L，Gabrielson N P，Uckun F M，et al.Size-dependent tumor penetration andinvivoefficacy of monodisperse drug-silica nanoconjugates[J].Mol Pharm，2013，10(3):883-892.