尾加壓素Ⅱ在醛固酮誘導大鼠腎臟纖維化的表達和意義

洪奮玲，張旭升，黃戰軍，朱平先，蔡博治

腎臟纖維化［1］是指細胞外基質異常增多和過度沉積，是導致腎功能衰竭的主要原因，所有腎臟疾病最終均可發展為腎臟纖維化，因此，如何有效防治腎臟纖維化是臨床面臨的一個重要難題。醛固酮由腎上腺皮質球狀帶合成和分泌的鹽皮質類固醇激素，主要作用為調節血壓、電解質和體液平衡；研究證實醛固酮是一個獨立的致纖維化因素，可引起體內多器官纖維化改變，如心肌、血管纖維化和腎臟等［2，3］。 而尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）［4］是體內最強的收縮血管的心血管活性肽，在腎臟亦有表達，并具有促多種細胞增殖和膠原蛋白合成等生物學效應，是否參與腎臟纖維化過程尚不清楚。據此，本實驗觀察在正常鹽飲食狀態下，尾加壓素Ⅱ在單純醛固酮增多誘導的大鼠腎臟纖維化的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品約8周齡雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，醛固酮購自Sigma公司，其余為進口或國產分析純試劑。

1.2 實驗分組及標本收集雄性SD大鼠隨機分2組，每組8只：（1）正常對照組：給予等量的生理鹽水肌肉注射；（2）醛固酮組：醛固酮組采用醛固酮皮下注射（20 μg/d），常規飼養8周。2%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，部分血標本4℃離心10 min，分離血清，－70℃保存；剩下血標本置入含有EDTA和抑肽酶的試管中，充分混勻，4℃離心10 min，分離血漿，－70℃保存。摘取腎臟，用冰生理鹽水沖洗后，部分組織石蠟包埋用于染色，剩下腎臟組織用錫箔紙包裹，－70℃保存待測。

1.3 腎臟組織Masson染色取大鼠腎臟石蠟塊，制作4 μm厚切片，常規脫蠟、水化、脫水，Masson復合染色液浸泡5 min，流水沖洗2次，0.2%醋酸水溶液稍洗， 流水沖洗 1次，1%磷鎢酸 5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，亮綠染色液5～10 min，0.2%醋酸水洗2次，經脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.4 血清肌酐濃度測定取血清，送汕頭大學醫學院第一附屬醫院檢驗科，采用肌氨酸氧化酶法檢測大鼠血清肌酐水平。

1.5 血漿和腎臟組織UⅡ含量的測定取血漿和腎臟組織標本，送至北京華英生物研究所，采用放射免疫法檢測。

1.6 統計學方法運用統計軟件Graph Pad Prism4。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腎臟Masson和HE染色比較Masson染色可見醛固酮大鼠腎小球、腎小管和腎間質大量膠原蛋白沉積，明顯纖維化，HE染色可見醛固酮大鼠腎小球體積縮小，球體不規則、細胞增生和局部硬化，腎小管管壁水腫，管腔不規則，見圖1、2。

2.2 大鼠血清肌酐濃度、血漿和腎臟組織UⅡ含量比較醛固酮組血清肌酐濃度明顯高于正常組，有統計學差異，見表1。

圖1 大鼠主動脈Masson染色（×100）

圖1 大鼠主動脈HE染色（×100）

表1 大鼠血清肌酐濃度、血漿和腎臟組織UⅡ含量比較

表1 大鼠血清肌酐濃度、血漿和腎臟組織UⅡ含量比較

與正常組比較，＊P＜0.01。

腎臟UⅡ含量（ng/g蛋白）正常組 8 40.35±2.34 2.27±0.82 0.19±0.15醛固酮組 8 86.13±3.33＊ 2.49±0.90 0.62±0.17＊組別 n 血清肌酐濃度（ng/L）血漿UⅡ含量（ng/L）

3 討論

腎臟纖維化是慢性腎病進展為終末期腎衰的必然途徑，其基本病理過程是細胞外基質過多地聚集、沉積及降解不足，多種細胞、活性因子共同參與這個過程，包括腎小球細胞系膜細胞活化、足細胞凋亡、腎小管上皮細胞轉分化以及多種炎癥細胞浸潤等，涉及多條信號通路如Smad、JAK/STAT信號通路等［5，6］，從而使腎臟組織受到嚴重破壞，影響腎功能。因此，如何有效防治腎臟纖維化具有重要的臨床意義。

研究發現，醛固酮是一種強的、獨立的致體內多器官纖維化的因子，包括腎臟、心臟和血管組織等。醛固酮可導致心肌、血管組織纖維化，而且該效應可被MR受體拮抗劑逆轉，可能涉及的分子機制包括氧化應激反應等［7］。該實驗在正常鹽飲食狀態下，采用外源性醛固酮干預8周后，可見大鼠腎小球體積縮小，球體不規則、細胞增生和局部硬化，腎小管管壁水腫，管腔不規則，腎小球、腎小管和腎間質大量膠原蛋白沉積，提示腎臟明顯纖維化，同時，血清肌酐明顯升高，表明腎臟濾過功能下降。并且，腎臟組織UⅡ的表達明顯上調，提示UⅡ參與腎臟纖維化的過程；然而，兩組血漿UⅡ含量無統計學差異，提示UⅡ是通過自分泌/旁分泌的方式發揮作用，而不是通過內分泌的方式作用。

目前認為促纖維化與抗纖維化因子的失衡是腎臟纖維化發生、發展的主要機制。許多血管活性因子在腎臟纖維化的發生發展中發揮重要的作用，如內皮素、AngⅡ在腎臟損傷時表達明顯上調，從而增加轉化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）、胰島素樣生長因子（insulin like growth faltor，IGF-1）等促纖維化因子的表達，導致細胞增殖、細胞外基質形成，發生纖維化［8］。而UⅡ是目前最強的縮血管活性肽，與內皮素、AngⅡ類似，在心血管組織、腎臟均有表達，主要是通過自分泌/旁分泌作用，具有促多種細胞增殖、動脈粥樣硬化和膠原蛋白合成等生物學效應，該作用是通過其特異受體（GRP14，UT）介導，涉及的信號轉導通路包括鈣離子、鈣調素、蛋白激酶C和絲裂素活化蛋白激酶等［9］。并且，促纖維化因子可以抑制抗纖維化因子的表達或者通過促纖維化因子之間的協同作用，從而促進腎臟纖維化的發生、發展。

該實驗發現正常鹽飲食狀態下，單純給予醛固酮可導致腎臟纖維化，同時，腎臟UⅡ的表達上調，結合UⅡ有促膠原蛋白沉積等生物學效應，提示UⅡ參與腎臟纖維化的進程，這為腎臟纖維化的機制研究及防治提供新的思路和作用靶點，而可能涉及的分子機制和信號通路需進一步研究明確。

參考文獻

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［2］張旭升，黃戰軍，周小歐，等.正常鹽飲食狀態下醛固酮增多對大鼠主動脈纖維化的作用和機制研究［J］.中國心血管雜志，2013，18（5）：370-372.

［3］BRILLA CG，WEBER KT.Mineralocorticoid excess，dietary sodium，and myocardial fibrosis［J］.J Lab Clin Med，1992，120（6）：893-901.

［4］張旭升，張勇剛.尾加壓素Ⅱ和冠心病［J］.中國心血管病研究雜志，2007，5（3）：303-305.

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［8］唐琳，李惠，張娜娜，等.缺氧誘導因子1α調控內皮素1表達在高糖誘導腎小管上皮細胞轉分化中的作用［J］.中華腎臟病雜志，2013，29（4）：375-377.

［9］劉文媛，韓清華，劉青華，等.尾加壓素Ⅱ誘導乳鼠心肌成纖維細胞增殖及膠原合成的信號轉導機制研究［J］.中國現代應用藥學，2016，33（7）：862-866.