萱草多倍體誘導及其鑒定

武 江，李 麗，曹冬梅，左力翔，王云山

（山西省農業科學院園藝研究所，山西太原030031）

萱草（Hemerocallis fulva）為百合科萱草屬多年生宿根草本地被植物，其植株低矮，株型挺拔，花色艷麗，花期長，抗性強，適栽范圍廣，觀賞和綠化價值高[1-3]。萱草屬植物根據基因型不同，分為二倍體、三倍體和四倍體。多倍體萱草因具有植株強壯、生長勢強、花莖粗、花大、花型多、顏色變異豐富等特點，在園林綠化、景觀營造中應用前景廣泛，也使育種者越來越關注萱草的多倍體育種。

多倍體植物具有營養器官巨大、活性成分含量高、抗逆性強等顯著特征[4-5]，與多倍體萱草育種目標的設定一致。多倍體育種是植物品種改良的重要手段，而組織培養則是植物品種保存和種性純化、擴大栽培的有效途徑[6]。化學誘變是植物多倍體誘導普遍采用的方法，而秋水仙素作為一種被廣泛采用且具有顯著效果的多倍體誘導藥劑，其對植物材料染色體結構影響甚微，很少發生遺傳上的不利變異[7]。由于誘變劑誘導多倍體的不穩定性、誘變率較低及鑒定方法的復雜性等，萱草多倍體育種進展緩慢，有關萱草的多倍體育種鮮見報道。

本研究借助浸泡法和混培法2種誘變方法篩選適宜獲得萱草多倍體的秋水仙素濃度和愈傷組織培養時間，利用流式細胞儀檢測細胞核DNA含量，并結合傳統的倍性鑒定方法對檢測結果進行驗證，以期建立高效的萱草多倍體誘導體系，為萱草多倍體新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為萱草二倍體雜交品種10-154（Hemerocallis fulva 10-154），通過組織培養獲得的愈傷組織由山西省農業科學院園藝研究所花卉研究中心提供。該二倍體愈傷組織生長健壯、組織緊密且帶綠色芽點。用刀片將其切成長、寬、高均為0.5 cm的立方體，備用。

1.2 試驗方法

通過秋水仙素浸泡法和混培法進行適宜濃度和培養時間篩選，每處理選取愈傷組織20塊，3次重復，共計60塊。通過比較存活率、形態變異率、誘變率和增殖系數，獲得最佳的處理組合。

1.2.1 浸泡法 用滅菌蒸餾水配制質量濃度分別為 0 （對照），0.01% ，0.03% ，0.05% ，0.10% ，0.20% ，0.30%的秋水仙素無菌溶液，過濾，滅菌，然后將愈傷組織小塊置于溶液中，保持小塊始終處于液面之下。將液體置于轉速為80～100r/min的搖床上，分別培養8，16，24 h。培養完成后，立即將愈傷組織小塊取出，以滅菌蒸餾水沖洗4次，每次沖洗持續5 min，之后用無菌吸水紙吸干表面水分，將小塊轉接到MS＋6-BA 0.1 mg/L＋KT0.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L分化培養基上，置于組織培養室培養。

1.2.2 混培法 用滅菌蒸餾水配制秋水仙素溶液，加至未凝固的分化培養基中配制成質量濃度分別為 0.001%，0.005%，0.020%，0.040%，0.080%的培養基，輕輕晃動使之分布均勻。待培養基凝固后接種愈傷組織。以添加相同體積滅菌蒸餾水的分化培養基為對照。將培養基置于組織培養室中分別培養5，10，15 h。分化培養基與浸泡法所用培養基成分相同。

1.2.3 指標統計與計算 組織培養室中愈傷組織的培養溫度為（25±2）℃，光強為2 500 lx，光照時間為16 h/d，培養基pH值為5.8。試驗進行25 d后，統計愈傷組織存活情況和不定芽增殖系數。然后將成活植株轉入生根培養基1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L中，15 d后統計形態變異率。在進行變異率統計時，以形態學變異和氣孔顯著性增大作為變異的初步鑒定指標。

存活率＝存活的外植體數/接種的外植體數×100%；增殖系數＝不定芽新增的株數/存活的不定芽數；形態變異率＝出現形態變化的外植體數/接種外植體數×100%；誘導率＝染色體發生變異的植株/（存活不定芽數+增殖不定芽數）×100%。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 DNA相對含量測定 用BDFACSCalibur流式細胞儀，采用Otto提取液對待測材料的根尖細胞進行DNA相對含量測定[8-9]。

1.3.2 根尖染色體數觀察 切取再生植株的幼嫩根尖，用對二氯苯預溶液處理4.5 h，之后在4℃條件下用卡諾固定液固定24 h，在水浴鍋的環境下用l mol/L鹽酸解離10 min，解離完畢后用卡寶品紅染色液染色。每再生植株統計20個以上細胞，以超過85%的細胞具有恒定、一致的染色體數作為該植株的染色體數目。用Olympus-IX71倒置顯微鏡在100倍目鏡下觀察，選取染色體分散均勻的細胞拍照[10]。

1.3.3 氣孔密度和保衛細胞大小測定 取待測植株，將葉片小心取下，采用張秀芳等[11]的印跡法進行氣孔鑒定。用蒸餾水清洗下表面，在該表面中部1 cm×3 cm的面積上均勻涂抹無色指甲油，干燥后將指甲油膜取下。將其與葉片接觸的一面向下，置于載玻片上并蓋好蓋玻片。在20×16倍鏡下隨機觀察10個視野，統計氣孔密度；在40×16倍鏡下測量保衛細胞大小。所有材料均選取相同葉位的葉片，3次重復。

1.3.4 葉片大小測定 選取再生植株葉片，用游標卡尺測量長度和寬度，并計算葉形指數（葉形指數＝長度/寬度）。所有葉片均取自不同倍性植株相同葉位。

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0進行數據統計分析，所有數據均經鄧肯式新復極差測驗。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素處理萱草的最佳方法篩選

2.1.1 浸泡法對萱草愈傷組織誘導的影響 由表1可知，同一培養時間下，所有秋水仙素質量濃度處理的愈傷組織存活率均顯著低于對照；在同一處理質量濃度下，愈傷組織存活率均隨處理時間的延長而顯著降低。就芽增值系數而言，不同質量濃度處理的系數均顯著低于相同條件下對照的數值；而同一秋水仙素濃度下，處理8 h的愈傷組織不定芽增殖系數均處于較高水平，表明用秋水仙素浸泡萱草進行多倍體誘導，并非培養時間越長越好。不同處理組合的愈傷組織的形態變異率比較，培養8 h以0.10%秋水仙素處理的最高（P＜0.05），為 52.22%；在16，24 h時具有最高形態變異率的秋水仙素處理質量濃度則分別為0.20%和0.03%，但這2個處理的值均較0.10%秋水仙素處理下培養8 h的處理低。在誘導率方面，0.30%秋水仙素處理的愈傷組織均未發現染色體發生變異的植株；在8，16，24 h培養時間下誘導率最高的秋水仙素質量濃度分別為 0.10%，0.05%，0.05%，以秋水仙素質量濃度為0.10%、培養時間為 8 h的處理誘導率最高（35.56%）。秋水仙素質量濃度過高或過低均使誘導率降低。綜合上述比較結果發現，用0.10%的秋水仙素浸泡萱草愈傷組織，在培養8 h時愈傷組織形態變異率、多倍體誘導率均最高，且具有相對較高的存活率和芽增殖系數，該組合最好。

表1 秋水仙素浸泡對萱草愈傷組織形成的影響

2.1.2 混培法對萱草愈傷組織誘導的影響 混培 法對萱草愈傷組織誘導的影響結果列于表2。

表2 秋水仙素混培對萱草愈傷組織形成的影響

從表 2 可以看出，質量濃度為 0.001%，0.005%，0.020%秋水仙素處理的萱草愈傷組織存活率隨培養時間的延長均呈顯著降低趨勢（P＜0.05），0.040%質量濃度下為10 h存活率最高；各處理在同一培養時間、不同質量濃度下的存活率均顯著低于同期對照，有8個組合的存活率均保持在25%以上。質量濃度為0.080%的秋水仙素處理萱草愈傷組織，不定芽增殖系數為0，說明該質量濃度對不定芽的形成不利；培養5 h時，以0.040%濃度的處理增殖系數最高（P＜0.05），其他培養時間下以對照的增殖系數最高。就形態變異率而言，秋水仙素質量濃度為 0.040%培養 10，15 h，0.080%及對照的形態變異率均為0；其他質量濃度下，形態變異率均隨培養時間的延長而升高；同一培養時間、不同濃度秋水仙素處理比較，形態變異率均以0.020%質量濃度下最高（P＜0.05），其次是 0.005%的處理。誘導率是評價愈傷組織誘導成功率的關鍵指標之一。由表2可知，濃度為0.005%的秋水仙素培養15 h具有最高的多倍體誘導率，其他處理均顯著低于該處理。綜合比較，認為以0.005%的秋水仙素混培，在培養15 h時愈傷組織具有最高的多倍體誘導率和較高的存活率、芽增殖系數和形態變異率，是混培法下萱草愈傷組織誘導的最佳組合。

2.2 細胞DNA相對含量比較

以2.1中得到的最佳愈傷組織組合誘導萱草多倍體植株，經形態學鑒定，篩選出變異株，進行流式細胞儀分析、檢測倍性，結果發現，所得誘變株中既有二倍體，又有四倍體和混倍體。圖1-A為已知倍性的二倍體，在熒光強度45處出現峰值；在圖1-B中，熒光強度90處出現尖峰，說明經秋水仙素誘導后植株的DNA相對含量是二倍體的2倍，該變異株為四倍體。

2.3 根尖染色體數比較

根尖染色體鑒定結果表明，二倍體萱草植株的細胞染色體數目為2n＝2x＝22（圖2-A）；對流式細胞儀鑒定出的四倍體植株的根尖染色體進行鑒定，發現其數目為2n＝4x＝44（圖2-B），是二倍體染色體數目的2倍，進一步確定該變異株為四倍體。染色體倍性鑒定結果與流式細胞儀鑒定結果一致。

2.4 氣孔性狀比較

由表3可知，四倍體植株葉片下表皮保衛細胞的長度、寬度均顯著高于二倍體植株，分別為二倍體植株的2.06倍和2.02倍。此外，單個視野氣孔個數以二倍體最多（P＜0.05），反映了其較高的氣孔密度，也說明四倍體植株葉片的氣孔較大。

表3 二倍體與四倍體植株氣孔特征比較

2.5 形態學比較

由表4可知，四倍體植株葉片的長度和葉形指數顯著低于二倍體；而寬度則相反。對萱草二倍體及經多倍體誘導得到的四倍體植株進行形態觀察，發現四倍體較二倍體植株矮小，莖基部較粗壯，葉片較寬，葉邊呈不規則卷曲、褶皺，生長較緩慢。試驗數據與實際觀察相吻合。

表4 二倍體與四倍體植株葉片特征比較

3 討論與結論

人工誘導多倍體是創建植物新種質或新類型的一個重要途徑，也是植物育種的一個重要手段[12]。通過植物離體組織誘導同源四倍體已成為獲得多倍體的有效途徑[13]。不同植物材料所用的秋水仙素濃度及處理時間不盡相同，確定特定植物、組織、器官的最佳秋水仙素處理濃度及時間，需要不斷探索[14]。本研究利用秋水仙素浸泡法和混培法誘導愈傷組織小塊，通過秋水仙素不同濃度和培養時間篩選，確定了萱草愈傷組織多倍體誘變的最佳處理，經不同方法鑒定評價，成功獲得了萱草的同源四倍體新材料，為萱草遺傳育種新途徑開發和新方法運用奠定了基礎。

將化學誘變與植物組織離體培養技術結合，對植物材料遺傳變異的誘發、繁殖、改良、選擇技術具有獨特的優勢和發展潛力。其不受環境條件限制，可節省時間，擴大變異譜，提高變異率[15-16]。有研究指出，秋水仙素雖在誘導植物多倍體育種中應用廣泛，效果顯著[17]，但它在使用過程中還可能存在副作用，即具有一定的毒害作用，常表現為對植株生長的抑制[18]。本試驗中，雖然通過浸泡法和混培法篩選到了萱草愈傷組織最佳處理濃度和培養時間，其愈傷組織存活率在所有處理中并非最高，芽增殖系數也并非最高，但誘導率卻最高，說明雖然所試驗的濃度和培養時間對愈傷組織的毒害作用存在，但仍可作為萱草多倍體誘導的適宜處理。

多倍體植物一般表現為莖粗、葉寬厚、顏色深、花大、果大、種子大而少[19]，植株“巨大性”非常明顯[20]。本研究中，四倍體與二倍體植株相比，具有較大寬度和較小的長度，葉片不規則，生長緩慢，與前人在其他植物上的研究結果類似[21-23]。

流式細胞儀測定法結合根尖染色體計數法是最可靠的多倍體鑒定方法。利用這2種方法結合進行葉片下表皮單位面積的氣孔大小、密度等形態學鑒定，可從多個方面對多倍體的倍性進行確定[24-27]。本試驗通過流式細胞儀進行萱草倍性鑒定，發現四倍體植株的DNA相對含量為二倍體的2倍，借助根尖染色體計數法鑒定多倍體倍性，所得結果也與流式細胞儀檢測結果一致，染色體數為原二倍體的2倍。在得到四倍體萱草的同時，也進一步驗證了流式細胞儀法檢測植物倍性的可靠性。

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