G2/M期P53/CDK1通路對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響

張瑞濤，史惠蓉，任 芳，曹 媛，姬鵬程，王文文

細胞周期檢驗點是細胞進入有絲分裂前修復DNA損傷的重要關卡，在G2/M期，細胞損傷信號可激活P53-P21WAF1和Chk1-CDC25通路，抑制CyclinB1/細胞周期依賴激酶1(cyclin dependent kinases 1，CDK1)復合物的活性和進入細胞核，引起G2期阻滯，啟動DNA損傷修復[1]。CDK1是G2/M期傳導網絡的核心因子，野生型p53基因主要通過作用于其靶因子P21WAF1調節CDK1的活性來調節G2/M檢驗點[2-3]。前期研究[4-5]表明，上皮性卵巢癌組織中存在P53蛋白高表達、P21WAF1蛋白低表達和CDK1蛋白高表達，隨著患者臨床分期的增加，P53表達逐漸增加、P21WAF1表達逐漸減少，CDK1高表達與臨床分期無關，P53、P21WAF1和CDK1可能協同參與了上皮性卵巢癌的發生發展。該研究利用小發卡RNA干擾技術研究P53/CDK1信號通路在卵巢上皮性癌細胞SK-OV-3、OVCAR-3細胞增殖和凋亡中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑人上皮性卵巢癌細胞SK-OV-3、OVCAR-3購自中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)；RPMI-1640完全培養基購自美國Hyclone公司；鼠抗人CDK1單克隆抗體、兔抗人磷酸化CDK1(Thr14/Tyr15)多克隆抗體、鼠抗人CyclinB1單克隆抗體、山羊抗人Ki-67多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；鼠抗人P53單克隆抗體、兔抗人磷酸化P53(ser15)多克隆抗體、鼠抗人P21WAF1單克隆抗體、兔抗人Survivin單克隆抗體、鼠抗人cleaved-Caspase3單克隆抗體、Western blot及IP蛋白裂解液、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物公司；增強化學發光(ECL)試劑盒、兔抗人β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、鼠抗兔單克隆IgG、DAB染色試劑盒均購自北京中杉金橋科技有限公司；TUNEL檢測試劑盒(POD法)購自美國Roche公司；CDK1、p53基因特異性shRNA質粒、陰性對照shRNA 質粒、shRNA 質粒轉染試劑購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養和轉染SK-OV-3、OVCAR-3細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基在37℃、5% CO2、相對濕度90%的培養箱中培養，至對數生長期收集細胞用于后續實驗。分別將CDK1、p53基因shRNA質粒及陰性對照質粒轉染SK-OV-3、OVCAR-3細胞，經嘌呤霉素(2 μg/ml，美國Sigma公司)篩選，擴增建株，實驗細胞分別命名為空白對照組、陰性對照組和沉默組。

1.3Westernblot法蛋白裂解液提取細胞樣本總蛋白，采用考馬斯亮藍法(Bradford法)進行蛋白定量。分別取30 μg總蛋白進行10% 十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)電泳，恒壓20 V半干轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，含5%脫脂奶粉、0.05%吐溫20枸櫞酸鹽緩沖液(TBST)室溫封閉2 h，按說明書濃度分別用一抗、二抗4 ℃孵育過夜，IgG(1 ∶2000)室溫孵育2 h。ECL發光試劑盒顯色后曝光，Image Pro-Plus 6.0軟件分析特異性目的條帶的灰度值，將β-actin設為內參照，分別計算其相對表達水平(目的蛋白灰度值/β-actin灰度值)，每組實驗重復3次。

1.4MTT法測定細胞增殖將各組細胞按1×104個/孔接種于96孔板，每組細胞設3個復孔，另設3個空白對照孔，常規培養24 h，此后每24 h向每孔內加入5 mg/ml MTT 20 μl，連續5 d，加入MTT作用4 h后棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO(美國Sigma公司)溶液，置于搖床上低速震蕩10 min，酶標儀(美國Thermo公司)測量492 nm波長處各孔的吸光度(absorbance，A)值(A492)，以培養時間為橫坐標，A492為縱坐標，繪制生長曲線。

1.5流式細胞術檢測細胞早期凋亡率每實驗組收集1×105個細胞，棄上清液，加入195 μl的Annexin V-FITC結合液重懸細胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻后，再加入10 μl碘化丙啶混勻，室溫、避光孵育15 min，冰浴后立即采用FACScan流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)檢測細胞早期凋亡情況，Cell Quest軟件進行分析，本實驗重復3次。

1.6TUNEL法檢測細胞晚期凋亡率在載玻片上滴加單細胞懸液，培養4～6 h至細胞貼壁，4%多聚甲醛(美國Sigma公司)固定25 min，PBS浸洗3次，0.2% Triton X-100孵育5 min，然后按TUNEL試劑盒說明書處理細胞，DAB染色后封片，高倍鏡(400倍)下隨機選取5個視野，計數每100個細胞中凋亡小體的數目，取均數計算細胞晚期凋亡率。

1.7流式細胞術檢測細胞周期分布情況分別收集對數生長期的3組細胞各1×106個，PBS漂洗細胞兩次，70%冰乙醇固定24 h，洗滌離心后加入含100 mg/L RNaseA的碘化丙啶，室溫避光染色后采用FACScan流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)檢測細胞周期時相變化，Mulpicycle for windows軟件分析結果。

2 結果

2.1CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響

2.1.1CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞增殖的影響 MTT結果顯示，轉染CDK1-shRNA質粒后SK-OV-3沉默組細胞(F=417.027，P<0.001)和OVCAR-3沉默組細胞(F=378.229，P<0.001)的增殖明顯受到抑制，而在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞增殖能力的影響

2.1.2CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞早期凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，轉染CDK1-shRNA質粒后SK-OV-3沉默組和OVCAR-3沉默組細胞的早期凋亡率明顯增加(P<0.001)，而在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞之間差異無統計學意義。見表1。

表1 分別沉默CDK1和p53基因對各實驗組細胞早期凋亡率的影響

2.1.3CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞晚期凋亡的影響 TUNEL結果顯示，轉染CDK1-shRNA質粒后SK-OV-3空白對照組、SK-OV-3陰性對照組和SK-OV-3沉默組細胞的晚期凋亡率分別為(4.67±0.58)%、(5.00±1.00)%和(26.67±2.08)%，差異有統計學意義(F=252.412，P<0.001)。OVCAR-3空白對照組、OVCAR-3陰性對照組和OVCAR-3沉默組細胞的晚期凋亡率分別為(6.67±1.53)%、(7.33±0.58)%和(31.67±3.06)%，差異有統計學意義(F=152.194，P<0.001)，而在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.1.4CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞周期分布的影響 流式細胞術檢查結果顯示，轉染CDK1-shRNA質粒后SK-OV-3空白對照組、SK-OV-3陰性對照組和SK-OV-3沉默組細胞的G2期細胞數目分別為(5.44±0.68)%、(5.08±1.57)%和(19.85±1.95)%，差異有統計學意義(F=94.991，P<0.001)。OVCAR-3空白對照組、OVCAR-3陰性對照組和OVCAR-3沉默組細胞的G2期細胞數目分別為(8.16±0.88)%、(7.60±0.84)%和(23.33±1.89)%，差異有統計學意義(F=141.416，P<0.001)。而在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖2 CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞晚期凋亡率的影響 DAB染色×400

圖3 CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞G2期細胞數目的影響

圖4 CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞G2/M檢驗點相關蛋白表達的影響

2.2CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞P53/CDK1通路相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示，CDK1基因沉默后SK-OV-3、OVCAR-3細胞中CDK1和p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表達明顯減少(P<0.05)，而P53、p-P53(ser15)、 P21WAF1、CyclinB1蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05)。此外，在SK-OV-3沉默組和OVCAR-3沉默組細胞中檢測到Ki-67、Survivin蛋白表達減少(P<0.05)，cleaved-Caspase3蛋白表達增加(P<0.05)。上述蛋白的表達在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

2.3p53基因沉默后對卵巢癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響

2.3.1p53基因沉默后對卵巢癌細胞增殖的影響 MTT結果顯示，轉染p53-shRNA質粒后SK-OV-3沉默組細胞(F=267.038，P<0.001)和OVCAR-3沉默組細胞(F=307.124，P<0.001)的增殖明顯受到抑制，而在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

2.3.2p53基因沉默后對卵巢癌細胞早期凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，轉染p53-shRNA質粒后SK-OV-3沉默組和OVCAR-3沉默組細胞的早期凋亡率明顯增加(P<0.001)，而在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖5 沉默p53基因后對卵巢癌細胞增殖能力的影響

2.3.3p53基因沉默后對卵巢癌細胞晚期凋亡的影響 TUNEL結果顯示，轉染p53-shRNA質粒后SK-OV-3空白對照組、SK-OV-3陰性對照組和SK-OV-3沉默組細胞的晚期凋亡率分別為(4.64±0.56)%、(6.00±1.00)%和(23.67±1.99)%，差異有統計學意義(F=178.647，P<0.001)。OVCAR-3空白對照組、OVCAR-3陰性對照組和OVCAR-3沉默組細胞的晚期凋亡率分別為(6.33±1.46)%、(7.00±1.00)%和(27.33±2.52)%，差異有統計學意義(F=132.655，P<0.001)，而在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

2.3.4p53基因沉默后對卵巢癌細胞周期分布的影響 流式細胞術檢測結果顯示，轉染p53-shRNA質粒后SK-OV-3空白對照組、SK-OV-3陰性對照組和SK-OV-3沉默組細胞的G2期細胞數目分別為(3.50±0.61)%、(3.44±0.75)%和(12.00±2.33)%，差異有統計學意義(F=34.229，P=0.001)。OVCAR-3空白對照組、OVCAR-3陰性對照組和OVCAR-3沉默組細胞的G2期細胞數目分別為(5.81±1.24)%、(5.88±1.18)%和(28.26±2.06)%，差異有統計學意義(F=210.030，P<0.001)。而在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

2.4p53基因沉默后對卵巢癌細胞P53-CDK1通路相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示，p53基因沉默后SK-OV-3、OVCAR-3細胞中P53、p-P53(ser15)、 P21WAF1蛋白表達明顯減少(P<0.05)，p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表達明顯升高(P<0.05)，而CDK1、CyclinB1蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05)。此外，在SK-OV-3沉默組和OVCAR-3沉默組細胞中檢測到Ki-67、Survivin蛋白表達減少(P<0.05)，cleaved-Caspase3蛋白表達增加(P<0.05)。上述蛋白的表達在SK-OV-3空白對照組和SK-OV-3陰性對照組細胞之間、OVCAR-3空白對照組和OVCAR-3陰性對照組細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖8。

圖6 沉默p53基因后對卵巢癌細胞凋亡能力的影響 DAB染色×400

圖7 沉默p53基因后對卵巢癌細胞G2期細胞數目的影響

圖8 沉默p53基因后對卵巢癌細胞G2/M檢驗點相關蛋白表達的影響

3 討論

卵巢上皮性癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤，由于卵巢居于盆腔深處、發病隱匿、疾病癥狀不典型等因素影響，大部分卵巢癌患者被診斷時已到疾病晚期，雖然可行系統的腫瘤細胞減滅術和以鉑類為基礎的聯合化療進行治療，但其死亡率仍高居婦科惡性腫瘤之首[6]。研究[7]表明，細胞周期調節異常和信號通路傳導異常與卵巢癌的發生發展關系密切。

G2/M檢驗點是細胞周期中除G1/S檢驗點之外最重要的細胞檢測點，是決定細胞一分為二的控制點，是細胞進入有絲分裂前修復DNA損傷的最后時機[3]。CDK1與CyclinB1結合形成異源二聚體CyclinB1/CDK1，又稱為細胞成熟促進因子(maturation promoting factor，MPF)，MPF是真核細胞有絲分裂G2/M期轉換所必需的蛋白激酶，只有活化的MPF才能觸發有絲分裂[8]。CDK1又名P34CDC2，是CDC2基因編碼的34 ku的蛋白質，其N末端第161個氨基酸蘇氨酸(Thr161)、第15個氨基酸酪氨酸(Tyr15)和第14個氨基酸蘇氨酸(Thr14)的磷酸化狀態對其活性的影響至關重要，其中Thr14/Tyr15位點的磷酸化和去磷酸化是調節CDK1活性的關鍵，CDK1去磷酸化激活后進而調節CyclinB1/CDK1復合物的活性，推動細胞進入有絲分裂期[9-10]。細胞DNA損傷時可使CDK1失活，最終導致細胞周期阻滯在G2期。

研究表明，在喉癌[11]、肺癌[12]、結直腸癌[13]和腎癌[14]等多種癌組織中均檢測到CDK1的高表達，其高表達與上述惡性腫瘤的預后有關，CDK1可能在上述惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用。抑制CDK1基因的表達后，卵巢癌細胞的增殖明顯受到抑制、凋亡明顯增加、G2期細胞數目增加，提示CDK1的異常表達與上皮性卵巢癌細胞的增殖和凋亡關系密切。進一步研究顯示，抑制CDK1基因表達對SK-OV-3、OVCAR-3細胞中P53、p-P53(ser15)、 P21WAF1、CyclinB1蛋白的表達無明顯影響，而CDK1和p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表達則明顯降低，同時細胞增殖相關蛋白Ki-67表達減少、凋亡抑制基因Survivin蛋白表達減少、凋亡相關蛋白cleaved-Caspase3蛋白表達增加，提示CDK1基因沉默后對卵巢癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響可能與CDK1蛋白的表達受到抑制有關。

多數惡性腫瘤細胞中存在p53基因突變和突變型P53蛋白高表達，p53基因在細胞周期G1/S期轉換、G2/M期轉換等多個環節中發揮重要作用，P21WAF1基因是野生型p53基因的主要靶因子之一[15]。抑制p53基因表達后，卵巢癌細胞的增殖明顯受到抑制、凋亡明顯增加、G2期細胞數目增加，提示P53蛋白異常表達與卵巢癌細胞的增殖和凋亡關系密切。進一步研究顯示，沉默p53基因后SK-OV-3、OVCAR-3細胞中P53、p-P53(ser15)、 P21WAF1蛋白表達明顯減少，p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表達明顯升高，而CDK1、CyclinB1蛋白的表達無明顯改變，同時Ki-67表達減少、Survivin表達減少、cleaved-Caspase3表達增加，上述結果說明抑制P53蛋白表達后可引起P21WAF1蛋白表達減少、CDK1蛋白的Thr14/Tyr15位點磷酸化增加、CDK1活性受到抑制，提示可能是通過P53-P21WAF1信號通路引起CyclinB1/CDK1復合物活性受到抑制，導致被阻滯在G2期的卵巢癌細胞數目增加，進而引起其下游細胞增殖和凋亡相關蛋白表達異常，最終引起卵巢癌細胞增殖抑制、凋亡增加。

綜上所述，本研究通過體外實驗顯示CDK1蛋白的異常表達與上皮性卵巢癌細胞的增殖和凋亡相關，G2/M檢驗點P53-P21WAF1-CDK1信號通路可能參與調節卵巢癌細胞的增殖和凋亡。在本研究基礎上進一步探討CDK1及G2/M檢驗點與卵巢癌的關系，有助于闡明卵巢癌發病與細胞周期調節異常的關系，也可為卵巢癌的臨床靶向治療提供潛在的治療靶點。

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