高血糖對胸椎黃韌帶骨化過程中BMP-2和TGF-β表達的影響

陳 達，張世峰，陳 曦，金群華

胸椎黃韌帶骨化(thoracic ossification of ligament flavum，OLF)最早在1912年被提出，可以導致椎管狹窄和脊髓功能障礙，臨床上比較多見[1]。糖尿病是一種全身性疾病，研究[2]顯示糖尿病小鼠胸椎OLF發生率高。骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic proteins, BMP-2)和轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在黃韌帶骨化的發病機制中相互協同[3-4]。糖尿病/高血糖是不是胸椎黃韌帶骨化的危險因素、是否參與到胸椎黃韌帶的骨化過程，目前尚不清楚。該研究原代培養胸椎黃韌帶細胞，高糖培養模擬高血糖狀態，采用免疫細胞化學及Western blot法探究高血糖狀態下胸椎黃韌帶骨化相關因子BMP-2和TGF-β表達，為臨床上糖尿病合并胸椎黃韌帶骨化的患者早期預防及治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器青霉素、鏈霉素、DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶(美國HyClone生物化學制品有限公司)；細胞培養瓶(美國CORNING公司)；胎牛血清(德國PAN生物技術公司)；生物素標記的二抗、BCA蛋白提取試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；CCK8溶液(日本株式會所同仁化學研究所)；BMP-2抗體、TGF-β抗體、β-actin抗體(英國Abcam公司)；垂直電泳儀及轉膜系統(北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)。

1.2黃韌帶細胞的原代培養及傳代選取胸椎黃韌帶骨化患者手術中切取骨化黃韌帶標本作為實驗組(骨化組)，另外取胸椎骨折患者黃韌帶標本作為對照組(骨折組)。用含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/μl的無菌PBS液沖洗3次，剝除纖維結締組織；在DMEM高糖中迅速將黃韌帶剪成1 mm3小塊，接種于25 ml的細胞培養瓶內，小塊間距離為0.5 cm左右。然后瓶底向上加入2 ml含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的DMEM高糖培養液，瓶底向上置于37 ℃、5% CO2培養箱2 h，使小塊微干涸，然后輕輕翻轉培養瓶，令瓶底向下，讓培養液慢慢覆蓋于瓶底上的組織小塊，置培養箱中靜置培養，3 d換1次培養液。待原代培養的細胞從組織塊長出，數量增加至細胞長滿瓶壁或占瓶壁80%～90%時進行傳代培養。吸棄原培養液，用PBS液洗凈殘留培養液，加0.25%胰蛋白酶0.5 ml消化后，用10%胎牛血清的培養液終止消化，按1 ∶2分裝接種入培養瓶。

1.3黃韌帶細胞的鑒定倒置顯微鏡觀察細胞形態變化及生長狀況，相差顯微鏡下采圖記錄。黃韌帶細胞波形蛋白染色，12孔板放置蓋玻片接種對數生長期細胞，培養10 d后取出爬片，PBS沖洗3次，每次5 min；10%福爾馬林浸泡10 min，PBS沖洗；3%BSA封閉40 min；滴加一抗(1:200稀釋)，置于濕盒4 ℃過夜；室溫復溫1 h，PBS沖洗；生物素標記的二抗(1 ∶200稀釋)A液20 min，PBS沖洗；B液20 min，PBS沖洗；DAB顯色2 min，蒸餾水終止；蘇木精復染10 min，0.1%鹽酸酒精分化2 s，蒸餾水沖洗，返藍10 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗為陰性對照。

1.4細胞活性檢測96孔板接種對數生長期的細胞懸液，5 000個/孔，100 μl/孔，設置對照組及高糖組，將培養板在培養箱中預培養10 d；加入不同濃度的葡萄糖始終濃度為30、40、50、60、70 mmol/L；干預24 h，每孔加入10 μl的CCK8溶液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2～4 h；酶標儀測定450 nm處的吸光度值，計算細胞活力。

1.5免疫細胞化學12孔板放置蓋玻片，接種對數生長期細胞，培養10 d后，給予藥物干預24 h，此時細胞融合達90%左右，取出細胞爬片；PBS沖洗；10%福爾馬林浸泡10 min，PBS沖洗；3%BSA封閉40 min；分別滴加一抗BMP-2(1 ∶300稀釋)、TGF-β(1 ∶200稀釋)，置于濕盒4 ℃過夜；室溫復溫1 h，PBS沖洗；生物素標記的二抗(1 ∶200稀釋)A液20 min，PBS沖洗；B液20 min，PBS沖洗；DAB顯色2 min，蒸餾水終止；蘇木精復染10 min，0.1%鹽酸酒精分化2 s，蒸餾水沖洗，返藍10 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗為陰性對照。每張爬片選取5個隨機但不重復的視野進行分析，使用IPP6.0病理圖像分析系統測定陽性顆粒的平均光密度值。

1.6Westernblot檢測蛋白表達量收集對數生長期細胞棄去培養液，冷Hanks液清洗，BCA蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，沸水10 min使蛋白變性。蛋白樣品用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳，后轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別加入一抗β-actin(1 ∶5 000稀釋) 、BMP-2(1 ∶2 000稀釋) 、TGF-β (1 ∶2 000稀釋)，4 ℃冰箱孵育過夜，TBST沖洗后加入相應生物素標記的二抗(1 ∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST沖洗，滴加化學發光試劑，凝膠圖像分析儀顯影，保存圖片，Image J 2X軟件分析數據。

2 結果

2.1光鏡下黃韌帶細胞形態的鑒定光鏡下胸椎黃韌帶細胞均勻分布，呈長梭形、多角形，胞質豐富，細胞核居中，見圖1A。波形蛋白陽性細胞可見棕黃色及淡黃色顆粒沉積在胞質，見圖1B。

圖1 黃韌帶細胞光鏡下觀察(A)及波形蛋白染色結果(B) ×400

2.2高糖培養下黃韌帶細胞的活性隨著葡萄糖濃度的增加，細胞活性逐漸降低，見圖2，其中50 mmol/L組細胞活性為(73.6±5.42)%，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，選用50 mmol/L進行后續實驗。

圖2 黃韌帶細胞活性檢測結果

2.3免疫細胞化學法檢測BMP-2和TGF-β的表達胸椎黃韌帶細胞胞質內棕黃色或淡黃色顆粒沉積為BMP-2和TGF-β免疫細胞化學染色陽性，見圖3、4。骨折對照組細胞BMP-2和TGF-β表達量均很少，骨化對照組BMP-2和TGF-β的表達量較骨折對照組明顯增加(P<0.05)，高糖培養后骨折高糖組及骨化高糖組BMP-2和TGF-β的表達均明顯增加(P<0.01)，而且骨化高糖組的表達量顯著高于骨折高糖組(P<0.01)。

圖3 黃韌帶細胞BMP-2免疫細胞化學染色結果 ×400

圖4 黃韌帶細胞TGF-β免疫細胞化學染色結果 ×400

2.4BMP-2和TGF-β蛋白表達水平BMP-2及TGF-β蛋白相對分子量為45、13 ku，胸椎黃韌帶細胞經Western blot檢測，骨化對照組BMP-2和TGF-β的表達量較骨折對照組明顯增加(P<0.05，P<0.01)，高糖培養后骨折高糖組及骨化高糖組BMP-2和TGF-β的表達均明顯增加(P<0.01)，而且骨化高糖組的表達量顯著高于骨折高糖組(P<0.01)，見圖5。

3 討論

胸椎黃韌帶骨化(thoracic ossification of ligament flavum, TOLF)多發生于黃種人[5]，在年齡超過65歲的亞洲人患病率可高達20%，以下胸椎和胸腰段脊椎多見，是一種特殊類型的異位骨化，其導致椎管狹窄、脊髓壓迫受損，出現一系列神經功能障礙的多樣化臨床表現[6-8]。韌帶的軟骨內成骨是TOLF的基本病理過程，其發病機制目前仍然不清楚，且目前主要治療方式骨化韌帶切除減壓效果并不理想，至今沒有有效的藥物阻止骨化的進展。因此通過對其病因學的研究，及早發現TOLF的高危人群，做到及時預防、診斷和治療顯得尤為重要。本研究原代培養骨化的胸椎黃韌帶細胞，高糖培養模擬糖尿病高血糖狀態，檢測胸椎黃韌帶骨化相關因子BMP-2和TGF-β表達，為臨床上糖尿病合并胸椎黃韌帶骨化的患者早期預防及治療提供理論依據。

圖5 Western blot法檢測黃韌帶細胞BMP-2和TGF-β表達

研究[9-10]顯示年齡、飲食、內分泌和代謝異常、生長因子、力學、氟化物、脊柱退變、創傷、炎癥、遺傳及成骨細胞等多種因素與TOLF的發病有關。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)是1965年在成人骨組織中提取的一種活性蛋白，其中BMP-2是骨誘導因子，在骨化過程中，BMP-2能夠獨立誘導異位骨化的蛋白因子，是韌帶骨化的啟動因子。Han et al[11]利用成骨樣細胞 MC3T3-E1，給予BMP-2刺激培養，發現成骨細胞的增生和分化顯著增加。轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)是生長因子家族的一員，是具有多種功能的蛋白多肽，可以調節細胞增殖、分化、促進細胞外基質合成等。TGF-β通過刺激黃韌帶細胞分泌膠原協助BMP-2在骨化后期刺激骨形成[12]。本研究結果顯示骨化黃韌帶細胞BMP-2和TGF-β的表達量明顯高于胸椎骨折患者的胸椎黃韌帶細胞。

糖尿病時全身性代謝疾病，對骨和關節等全身器官均有影響[13]。正常的血糖對于椎間盤細胞、黃韌帶細胞等的生存和細胞外基質的穩定都非常重要，但高血糖會影響椎間盤細胞的濃度梯度、椎間盤的內環境，誘導氧化應激、內質網應激，引發椎間盤細胞、黃韌帶細胞等發生凋亡[14-15]。另一方面，糖尿病微血管病變影響椎間盤血供，內皮細胞壞死、凋亡等[16]。Braddock et al[2]利用小鼠糖尿病模型發現，血糖升高導致胰島素樣生長因子( insulinlike growth factor，IGF)升高，最終糖尿病小鼠TOLF發生率增加。利用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型，結果顯示腎小球TGF-β在腎病早期呈進行性增高。Gilbert et al[17]利用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型，也發現在小管上皮細胞中TGF-β mRNA和Ⅳ型膠原mRNA彌漫升高，誘導后6個月中TGF-β及Ⅳ型膠原表達持續升高。同時也證實TGF-β在糖尿病增殖期視網膜病變形成過程中起關鍵作用。張亮 等[18]研究發現糖尿病患者腰椎黃韌帶中BMP-2表達較非糖尿病患者增高。本研究結果顯示，高糖狀態下骨化的胸椎黃韌帶細胞及胸椎骨折患者的黃韌帶細胞BMP-2和TGF-β的表達量均明顯增加，而且骨化組高于骨折組，提示高血糖促進BMP-2和TGF-β的表達。

綜上所述，本研究原代培養胸椎黃韌帶細胞，在模擬糖尿病高血糖狀態下，骨化黃韌帶細胞和胸椎骨折患者的黃韌帶細胞骨化相關因子BMP-2和TGF-β表達明顯增加，提示糖尿病/高糖不但是胸椎黃韌帶骨化的危險因素。但是糖尿病是全身性疾病，涉及多代謝途徑及多器官，對胸椎黃韌帶骨化的作用應該是多方面而復雜的，其詳細機制尚需進一步深入研究。

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