M-CSF血清水平與慢性HBV感染患者肝臟纖維化程度的相關(guān)性研究

王殷秋，曹雯君，郜玉峰，馬雙雙，葉 珺，鄒桂舟，沈玉先

持續(xù)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是慢性肝病發(fā)展成為肝纖維化的重要因素[1]。巨噬細(xì)胞作為肝臟炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞，在炎癥中發(fā)揮炎性細(xì)胞調(diào)節(jié)、募集和激活肝星狀細(xì)胞的作用[2]。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)主要由活化的巨噬細(xì)胞，子宮內(nèi)膜上皮分泌細(xì)胞，激活的成骨細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生[3-6]，是調(diào)節(jié)單核-巨噬細(xì)胞系細(xì)胞分化、增殖與生長(zhǎng)的主要細(xì)胞因子[7]。早期研究[8]顯示，M-CSF的血清水平與急慢性肝病及肝硬化關(guān)系密切，且與轉(zhuǎn)氨酶水平相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，M-CSF能通過(guò)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥、免疫反應(yīng)參與肝纖維化的病變過(guò)程[9]。

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我國(guó)慢性肝病患者發(fā)生肝臟纖維化的重要因素之一。慢性肝病患者肝臟纖維化程度的診斷尤為重要，若能早期做出準(zhǔn)確診斷，并積極干預(yù)，可以逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)展。該文探討M-CSF在不同程度肝纖維化的慢性HBV感染患者血清中表達(dá)水平差異，并分析其與其他采用臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性，比較其與經(jīng)典血清學(xué)無(wú)創(chuàng)診斷模型及瞬時(shí)彈性成像檢測(cè)肝纖維化的價(jià)值差異，有助于進(jìn)一步闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2014年1月～2016年3月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科的175例慢性HBV感染患者為研究對(duì)象，所有患者診斷符合中國(guó)慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。入組患者年齡16～67(39.10±11.45)歲；男女比例為2.80(129/46)；入組患者條件需符合：① HBV慢性感染病史>6個(gè)月，肝穿檢查前3個(gè)月以上未接受護(hù)肝治療及抗病毒治療；② 排除合并酒精性肝病、自身免疫性肝病、脂肪肝、其他嗜肝病毒感染或其他原因引起的肝功能異常；③ 排除合并嚴(yán)重其他系統(tǒng)疾病，如心血管疾病、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等；④ 排除合并梅毒感染及HIV感染。同時(shí)選取19例健康體檢者作為對(duì)照；所有入組的研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1M-CSF血清水平檢測(cè) 采集HBV感染者及健康體檢者空腹外周血,分離血清保存在-80 ℃冰箱，避免反復(fù)凍融。采用美國(guó)R&D sistems公司的Human M-CSF ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行樣本檢測(cè)。

1.2.2其他臨床指標(biāo)及病毒學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 乙肝五項(xiàng)定量采用雅培化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，HBV DNA采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，采用美國(guó)Beckman公司全自動(dòng)生化分析儀及其試劑分別檢測(cè)肝功能，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)(正常范圍：9～50 U/L)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)(正常范圍：15～40 U/L)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)(正常范圍：35～135 U/L)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase,GGT)(正常范圍：7～45 U/L)、白蛋白(albumin,ALB)(正常范圍：45～55 g/L)、球蛋白(正常范圍：20～40 g/L)。采用美國(guó)Beckman LH750 血球分析儀進(jìn)行血小板(platelet, PLT)檢測(cè)(正常值范圍 100×109/L～300×109/L)。

1.2.3肝臟活組織檢查及病理診斷 超聲引導(dǎo)下行1 s快速穿刺活檢術(shù)穿刺獲取患者長(zhǎng)度1.5～2.0 cm的肝臟組織，將標(biāo)本固定于甲醛中，后進(jìn)行石蠟包埋、連續(xù)切片，經(jīng)HE染色及網(wǎng)狀纖維或Masson三色染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察，由兩名病理醫(yī)師閱片診斷。根據(jù)《2000年病毒學(xué)肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝臟炎癥活動(dòng)度分級(jí)(G0～G4)及纖維化分期診斷(S0～S4)。

1.2.4瞬時(shí)彈性成像檢測(cè)及多參數(shù)無(wú)創(chuàng)診斷模型計(jì)算 所有患者肝穿前使用Fibrotouch瞬時(shí)彈性成像檢測(cè)儀獲取肝臟硬度測(cè)量值(liver stiffness measurement，LSM)。APRI評(píng)分計(jì)算方法：APRI=[(AST/ULN×100)/PLT(109/L],其中ULN為ASL正常參考值上限。FIB-4指數(shù)計(jì)算公式為：FIB-4=(年齡×AST)/[PLT×(ALT的平方根)]。

2 結(jié)果

2.1M-CSF在不同纖維化和炎癥程度的慢性HBV患者的血清中的表達(dá)比較15例S0期患者、56例S1期患者、37例S2期患者、40例S3期患者、26例S4期患者以及19例健康者的M-CSF血清水平,顯示健康者與S0期患者之間、S1期與S2期患者之間、S3與S4期患者之間的M-CSF血清水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，將患者分為無(wú)肝纖維化組(S0期及健康對(duì)照組)、輕中度肝纖維化組(S1-S2期)、重度肝纖維化組(S3-S4期)，各組之間M-CSF血清水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 2)。按照肝臟炎癥G分級(jí)，將入組患者分為5組，分別為無(wú)炎癥組(G0及正常對(duì)照組)、匯管區(qū)炎癥組(G1)、輕度碎屑?jí)乃?piecemeal necrosis,PN)組(G2)、中度PN組(G3)和重度PN組(G4)，M-CSF的血清水平在各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同肝臟纖維化及炎癥程度的慢性HBV感染者M(jìn)-CSF血清表達(dá)水平比較

2.2M-CSF血清水平與HBV病毒學(xué)指標(biāo)之間關(guān)系將175例肝纖維化患者按照HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果分為2組，HBV DNA>2 000 IU/ml組(n=146)和HBV DNA<2 000 IU/ml(n=29),兩組患者M(jìn)-CSF血清水平范圍分別在62.03～1 710.08 pg/ml和60.33～1 035.41 pg/ml。兩組之間M-CSF血清水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。將入組所有患者分為HBeAg陽(yáng)性組(n=66，M-CSF血清水平范圍為97.93～1 101.79 pg/ml)與HBeAg陰性組(n=109，M-CSF血清水平范圍為60.33～1 710.08 pg/ml)，兩組之間患者M(jìn)-CSF血清水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 M-CSF血清水平在不同病毒學(xué)分組之間的差異比較

2.3M-CSF血清水平與肝功能指標(biāo)之間的關(guān)系175例患者M(jìn)-CSF血清水平與ALT、AST、ALP、GGT、ALB和球蛋白等肝功能指標(biāo)之間的相關(guān)性分析顯示：M-CSF的血清水平與AST、ALP和GGT之間呈顯著正相關(guān)性(rs=0.169、0.167、0.151，P<0.05)，與ALB之間呈顯著負(fù)相關(guān)性(rs=-0.234，P=0.002)。而M-CSF的血清水平與其他肝功能指標(biāo)之間無(wú)顯著相關(guān)性。各相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)描述見(jiàn)表1。

表1 M-CSF及其他指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)描述

2.4M-CSF的無(wú)創(chuàng)診斷肝纖維化價(jià)值分析根據(jù)M-CSF血清水平、APRI指數(shù)、FIB-4指數(shù)及LSM診斷≥S1期(發(fā)生纖維化)患者的ROC曲線分析出AUC值及其95%CI、P值、靈敏度、特異性，數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表2；同時(shí)比較四種診斷指標(biāo)的AUC顯示， M-CSF血清水平與FIB-4指數(shù)、LSM對(duì)≥S1期(存在纖維化)患者診斷的AUC之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002、0.006)；而M-CSF與APRI二者的診斷效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3A。

M-CSF血清水平、APRI指數(shù)、FIB-4指數(shù)及LSM診斷S4期(早期肝硬化)患者的AUC值及95%CI、P值、靈敏度、特異性亦見(jiàn)于表2。四種檢測(cè)方法的AUC比較結(jié)果表明M-CSF血清水平與APRI、LSM之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 7、0.001 5)；而M-CSF與FIB-4指數(shù)的AUC之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3B。

表2 M-CSF及其他診斷模型診斷≥S1期及S4期的AUC分析

圖3 四種診斷指標(biāo)預(yù)測(cè)纖維化的ROC曲線比較

3 討論

在中國(guó)慢性HBV感染是患者發(fā)生肝纖維化的重要病因之一。由于慢性乙型肝炎的長(zhǎng)期遷延不愈，導(dǎo)致肝臟組織細(xì)胞持續(xù)損傷，炎性單核細(xì)胞在肝臟趨化聚集，分化成促纖維化的巨噬細(xì)胞，也同時(shí)激活肝臟固有的枯否氏細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞，最終誘導(dǎo)大量的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，并擾亂其產(chǎn)生與降解之間的平衡，最終在肝內(nèi)大量沉積[10]。M-CSF這一調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞系細(xì)胞分化增殖生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因子，作為促炎性細(xì)胞因子參與了眾多炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，肝纖維化也不例外[9]。

本研究通過(guò)對(duì)19例健康志愿者及175例不同纖維化分期的慢性乙型肝炎患者的M-CSF血清表達(dá)水平分析結(jié)果表明，炎癥分級(jí)越高的患者通常M-CSF血清水平越高；患者M(jìn)-CSF的血清水平與AST、AKP和GGT水平呈顯著正相關(guān)性，與ALB呈顯著負(fù)相關(guān)性，這些都證實(shí)了M-CSF的血清水平與傳統(tǒng)的檢測(cè)肝功能的指標(biāo)一樣，可以反映患者肝臟細(xì)胞、組織的損傷及肝臟功能[8]。本研究將入組的所有患者按照HBV DNA分為2組，觀察患者體內(nèi)HBV的復(fù)制與血清M-CSF水平之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示HBV DNA>2 000 IU/ml組患者的M-CSF血清水平高于HBV DNA<2 000 IU/ml組患者。這說(shuō)明乙肝病毒復(fù)制活躍的患者具有相對(duì)較高水平的M-CSF，這可能是由于病毒復(fù)制活躍加速了肝臟損傷和炎癥反應(yīng)，活化的星狀細(xì)胞以及損傷的肝細(xì)胞產(chǎn)生大量的M-CSF[9]。至于M-CSF是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的功能從而促進(jìn)病毒的復(fù)制，有待于進(jìn)一步研究。

M-CSF在纖維化早期能夠提高單核細(xì)胞趨化因子CCL2、CCL4及其受體的表達(dá)水平，使肝外單核細(xì)胞募集進(jìn)入肝臟病變區(qū)域，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的持續(xù)[11-12]。在纖維化發(fā)展的后期，M-CSF還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化為M2型，促進(jìn)HSC的過(guò)度激活，促進(jìn)纖維化的進(jìn)展和腫瘤的發(fā)生[9,13]。那么，M-CSF作為促纖維化的細(xì)胞因子，是否可以作為診斷肝纖維化分期的血清學(xué)指標(biāo)，這一點(diǎn)有待證實(shí)。本研究顯示，M-CSF血清濃度在無(wú)肝纖維化、輕中度纖維化及重度纖維化三組患者之間具有顯著差異；通過(guò)對(duì)其診斷≥S1期(發(fā)生肝纖維化)的ROC曲線分析顯示其AUC為0.827，敏感度和特異性分別為74.4和80.0，這表明M-CSF對(duì)于慢性乙肝患者是否已經(jīng)發(fā)生肝臟纖維化病變具有一定的診斷意義。對(duì)比其他診斷指標(biāo)顯示，在對(duì)≥S1期肝纖維化的診斷有意義的基礎(chǔ)上，認(rèn)為M-CSF的診斷價(jià)值優(yōu)于LSM；而M-CSF與APRI二者對(duì)疾病診斷效能無(wú)顯著差異。

通過(guò)對(duì)M-CSF預(yù)測(cè)S4期(早期肝硬化)的ROC曲線的分析顯示，其AUC為0.627，敏感度為59.7，特異性為73.0，由此可見(jiàn)M-CSF對(duì)早期肝硬化的診斷效果較其他指標(biāo)稍差。通過(guò)與其他診斷指標(biāo)的ROC曲線對(duì)比分析表明，APRI指數(shù)及LSM對(duì)早期肝硬化的診斷價(jià)值優(yōu)于M-CSF。M-CSF對(duì)早期肝硬化(S4期)的診斷效能稍差，目前暫考慮與入組的樣本量較少有關(guān)；或者可以通過(guò)聯(lián)合其他和M-CSF相關(guān)的指標(biāo)聯(lián)合診斷來(lái)提高其診斷效能。

現(xiàn)普遍認(rèn)為，單核巨噬細(xì)胞是除HSC外在肝臟纖維化病變發(fā)展中最為重要的細(xì)胞。M-CSF主要是通過(guò)各種不同途徑調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞功能來(lái)促進(jìn)纖維化的進(jìn)展。而在對(duì)肝癌及癌旁組織的研究[14-15]中顯示，M-CSF及其受體在肝癌周圍組織中的表達(dá)與患者發(fā)生腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及行肝癌切除術(shù)后的不良預(yù)后相關(guān)，推測(cè)M-CSF以及受體可能是一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。那么M-CSF是否也可以成為調(diào)控肝纖維化的靶點(diǎn)，為新藥的開(kāi)發(fā)提供新的方向，值得進(jìn)一步探討。

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