β-欖香烯誘導人結腸癌細胞DLD-1的增殖抑制和凋亡研究

汪國玉，張 蕾，耿亞迪，馮曉俊，陳昭琳，趙曉曉，姜 玲,，魏 偉

欖香烯是從傳統中藥姜黃屬溫郁金中提取分離的一種新型抗腫瘤藥物，β-欖香烯是其主要成分，占60%～72%[1]。到目前為止，β-欖香烯作為一種非細胞毒性抗腫瘤藥物，臨床上已經用于腦癌、乳腺癌及肝癌等一些腫瘤的治療[2]。結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國男女發病率和死亡率呈顯著上升趨勢，且多數患者發現時已屬于中晚期[3]。目前結腸癌的治療多以手術為主，5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等化療和放療為輔，但會出現惡心嘔吐、脫發、免疫功能下降等副作用，且患者容易復發，因此急需有效低毒的抗腫瘤藥物治療結腸癌[4]。有研究[5-6]表明β-欖香烯對結腸癌HT-29細胞和Lovo細胞有抑制增殖作用，但具體作用特點和機制尚未提及。故該研究旨在觀察β-欖香烯對結腸癌細胞DLD-1增殖及凋亡的影響，并初步探討β-欖香烯對DLD-1細胞活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑β-欖香烯(大連金港制藥有限公司)；CellTiter 96?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒(MTS)(普洛麥格北京生物技術有限公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(貝博生物有限公司)；Hoechst 33342活細胞染色液(100×)、活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA)、Western及IP細胞裂解液、PMSF(100 mmol/L)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；凋亡抗體套盒(美國Cell Signaling Technology公司)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2細胞培養DLD-1細胞由安徽醫科大學藥學院細胞庫饋贈，復蘇后加入含10%胎牛血清、20 U/ml的青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養基，于37 ℃、5% CO2的條件培養箱中培養。待細胞長至80%～90%時用胰酶消化進行傳代，細胞傳3代穩定后采用狀態良好的對數生長期細胞進行實驗操作。

1.3MTS法檢測細胞活力胰酶消化處于對數生長期的DLD-1細胞并制成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種至96孔板中，每孔200 μl，當細胞長至50%～60%時依序加入不同濃度β-欖香烯(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)作為藥物組，設一個空白對照組，每組設6個復孔。分別處理24、48、72 h后，顯微鏡觀察細胞生長狀況。相應時間后每孔加入MTS/PMS混合物40 μl，1 h后于490 nm波長下測定各孔吸光度( optical density，OD)值。結果以細胞活力大小表示，細胞活力(%)=藥物組OD / 空白對照組OD ×100%。

1.4克隆形成實驗取對數生長期DLD-1細胞接種到6孔板中，每孔2 ml，1×103個細胞；待細胞貼壁后每孔依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設一個空白對照組。24 h后吸棄藥液，每孔加入2 ml含10%胎牛血清、20 U/ml的青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養基后繼續培養，每隔2 d換液1次。待長出細胞集落，14 d后處理。PBS清洗細胞2次，每孔加入1 ml多聚甲醛固定液固定30 min后吸棄，加入1 ml過濾的結晶紫染色液染色15 min，用清水輕輕沖掉結晶紫染色液，將6孔板殘余的水分晾干、拍照。

1.5Hoechst33342染色實驗取對數生長期DLD-1細胞接種到12孔板中，每孔1 ml，1×105個細胞；待細胞貼壁后每孔依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設一個空白對照組。24 h后吸棄藥液，PBS清洗1次，每孔加入1 ml Hoechst 33342染色液，放入培養箱孵育15 min后吸棄，PBS清洗2次后于熒光顯微鏡下觀察。

1.6AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡取對數生長期DLD-1細胞接種到6孔板中，細胞密度為105個/ml。待細胞貼壁后依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設一個空白對照組。置培養箱中培養24 h后用不含EDTA的胰酶消化細胞，并進行細胞計數，取5×105個細胞進行Annexin V-FITC細胞凋亡檢測實驗。細胞收集后用冷PBS洗滌2次，離心后用400 μl 1× Annexin V結合液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC進行染色，2～8 ℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI染色液輕輕混勻，于2～8 ℃避光孵育5 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.7Westernblot法檢測凋亡相關蛋白的表達β-欖香烯(100、200、300 μmol/L)及空白對照組處理DLD-1細胞24 h后，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并將蛋白調整為相同濃度。SDS-PAGE法將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，兔抗人GAPDH(1 ∶1 000)、Cleaved PARP(1 ∶1 000)、PARP(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-9(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和Caspase-3(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，顯影。

1.8ROS檢測

1.8.1熒光顯微鏡觀察ROS水平 β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)及空白對照組處理DLD-1細胞24 h后，PBS清洗2次，每孔加入1 ml DCFH-DA熒光探針，放入培養箱孵育20 min，用無血清培養基清洗3次，去掉未進入細胞的DCFH-DA，熒光顯微鏡下觀察。

1.8.2流式細胞術檢測ROS水平 β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)及空白對照組處理DLD-1細胞24 h后，收集細胞于1.5 ml離心管，用PBS清洗2次離心，每管加入1 ml DCFH-DA熒光探針，吹打混勻放入培養箱孵育20 min，3 min顛倒混勻1次，用無血清培養基清洗3次，充分去掉未進入細胞的DCFH-DA，上機檢測。

2 結果

2.1β-欖香烯對DLD-1細胞活力的影響β-欖香烯(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)處理細胞24 h后，倒置顯微鏡下觀察，空白對照組細胞貼壁生長，呈不規則梭形、邊緣光滑；β-欖香烯藥物組隨著藥物濃度的升高，細胞存活數目減少、細胞間隙變大，細胞皺縮且形態模糊，見圖1。MTS法結果顯示，50～400 μmol/L β-欖香烯顯著抑制DLD-1細胞的活力(F=97.78、153.3、175.7，P<0.05，P<0.01)，見圖2。

圖1 β-欖香烯處理DLD-1細胞24 h后細胞形態 ×200

圖2 β-欖香烯抑制DLD-1細胞增殖

2.2β-欖香烯對DLD-1細胞克隆形成能力的影響克隆形成實驗結果表明，β-欖香烯顯著抑制DLD-1細胞增殖。與空白對照組相比，隨著β-欖香烯濃度增大，細胞克隆數目變少，細胞集落數逐漸減少(F=337.9，P<0.01)，見圖3。

2.3β-欖香烯對DLD-1細胞核的影響β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)處理細胞24 h后進行Hoechst 33342染色，結果顯示細胞均出現藍染，空白對照組細胞核規則均勻，核膜完整，但藥物組隨著β-欖香烯濃度增加，部分細胞核成碎塊狀，核染色質固縮發生高亮呈現致密濃染(F=140.9，P<0.05，P<0.01)，見圖4。

2.4β-欖香烯對DLD-1細胞凋亡的影響采用β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)處理DLD-1細胞24 h后，與空白對照組相比，β-欖香烯給藥組的凋亡率增加(F=305.4，P<0.01)，表明當β-欖香烯濃度增大時，可以誘導DLD-1細胞出現凋亡，抑制細胞的生長，見圖5。

圖3 β-欖香烯對DLD-1細胞克隆形成能力的影響

圖4 Hoechst 33342染色實驗測定DLD-1細胞凋亡 ×200

圖5 β-欖香烯誘導DLD-1細胞凋亡

圖6 β-欖香烯對DLD-1細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.5β-欖香烯對DLD-1細胞凋亡相關蛋白表達的影響Western blot結果表明，β-欖香烯作用DLD-1細胞24 h后，Cleaved PARP、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3表達水平隨著β-欖香烯濃度增大而增加；PARP、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達水平變化不明顯(F=18.61、7.92、261.3、33.68、213.9、17.99，P<0.01)。提示β-欖香烯促進PARP、Caspase-9和Caspase-3蛋白剪切，促進了DLD-1細胞的凋亡，見圖6。

2.6DLD-1細胞內ROS的表達熒光顯微鏡下觀察結果顯示，β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作用于DLD-1細胞24 h后，與空白對照組相比，β-欖香烯藥物組DCF的熒光強度依次增加(F=279.7，P<0.01)，流式細胞儀檢測結果與熒光顯微鏡相一致(F=280.22，P<0.01)，表明β-欖香烯濃度增大使細胞內ROS水平增加，見圖7、8。

圖7 熒光顯微鏡下觀察β-欖香烯對DLD-1細胞內ROS的影響 ×100

圖8 流式細胞儀檢測β-欖香烯對DLD-1細胞內ROS的影響

3 討論

姜黃屬植物莪術作為我國常用的傳統中藥，具有行氣止痛、積散結、破血祛瘀作用，《醫家心法》論“廣茂即莪術，凡行氣破血，消積散結皆用之”等。大量研究[7-8]表明莪術對多種腫瘤如乳腺癌、肝癌及胃癌等有很好的治療作用，β-欖香烯是從中藥莪術根莖中提取并分離的有效活性單體，其具有低毒有效、廣譜的性質，對多種腫瘤有明顯的抑制作用，是臨床上常用的抗腫瘤藥物。有研究[9]表明，β-欖香烯作為一種天然的抗血管生成劑，可以通過抑制VEGF介導的血管生成，抑制黑素瘤的生長和轉移。另外，β-欖香烯通過上調P53蛋白的表達促進外泌體的釋放，抑制人肺癌細胞的增殖[10]。在本研究中，MTS實驗和克隆形成實驗顯示，β-欖香烯能夠顯著抑制結腸癌DLD-1細胞的增殖。

在一定條件下，細胞受內在遺傳機制的控制自動結束生命的過程稱之為細胞凋亡，其對多細胞生物體的胚胎發育和組織穩態起著至關重要的作用[11]。當細胞發生凋亡時，細胞體積縮小，線粒體膜電位消失，核質濃縮，DNA降解，胞膜內側外翻到膜表面，最終細胞被分割包裹為幾個凋亡小體，繼而被吞噬細胞吞噬[12]。在細胞凋亡過程中Caspases扮演著十分重要的角色，細胞凋亡過程其實就是Caspases不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程。當細胞色素C進入細胞質后，募集Caspase-9前體并使其剪切活化，從而進一步激活效應Caspase-7和Caspase-3，而PARP是細胞凋亡核心元件Caspase-3 的切割底物，共同啟動Caspase級聯反應，最終引發細胞凋亡[13]。本研究探討了β-欖香烯誘導DLD-1細胞凋亡的初步機制。Hoechst 33342染色顯示β-欖香烯可使細胞出現細胞核聚縮和致密濃染的表現，Annexin V/PI雙染結果表明，β-欖香烯可誘導DLD-1細胞出現凋亡；Western blot結果表明β-欖香烯誘導DLD-1細胞凋亡與PARP、Caspase-3、Caspase-9的活化有關。以上說明β-欖香烯作為中藥有效活性成分能夠誘導結腸癌DLD-1細胞發生凋亡。

ROS作為一種自由基，與腫瘤之間的關系密切，越來越多的研究表明ROS不僅與腫瘤的發生和發展有關，還和腫瘤的治療有著密切聯系。ROS在不同水平下會有不同的作用。低水平的ROS促進細胞分裂與增殖，中等水平的ROS導致細胞周期阻滯，而高水平的ROS誘導細胞發生凋亡或壞死[14]。許多抗癌藥物如烷化劑和喜樹堿等會通過介導ROS的大量釋放和線粒體膜電位的變化，激活Caspase-3 等蛋白酶來誘導癌細胞發生凋亡[15]。本研究觀察了β-欖香烯對ROS的影響，熒光顯微鏡下觀察和流式細胞儀檢測結果顯示β-欖香烯處理DLD-1細胞24 h后，隨著β-欖香烯作用濃度增加，藥物組細胞內ROS 水平與空白對照組相比明顯增加，表明ROS可能在β-欖香烯抑制DLD-1細胞增殖及誘導凋亡中發揮重要作用。

綜上所述，β-欖香烯抑制人結腸癌細胞DLD-1的增殖并誘導細胞凋亡，這可能與ROS升高及上調凋亡相關蛋白有關，為β-欖香烯應用于結腸癌的臨床治療提供了實驗依據。

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