甲基阿魏酸對乙醇誘導HSC-LX2細胞NOX4和α-SMA表達的影響

程 琪，李勇文，李 麗，楊成芳，鐘毓娟

肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纖維化發生過程中起重要作用，其增殖與活化是肝纖維化發生的重要誘因，活化的HSC分泌大量細胞外基質(extracellular matrix,ECM)，交聯形成纖維束，導致肝纖維化的發生[1]。酒精代謝會產生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，ROS作為一個關鍵的第二信使參與人體內許多信號通路，包括轉錄調控、分化和增殖等[2]。研究[3-4]表明ROS可通過MAPK信號通路、TGF-β信號通路以及PI3K-Akt等多條細胞信號通路導致HSC活化和增殖。酒精可以誘導煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)的高表達來加快自身的代謝，代謝過程消耗O2產生大量的ROS[5]。NOX至少有七種亞型，肝臟中主要表達NOX1，不表達或少表達NOX4，均需與NADPH氧化酶亞基p22phox(p22phox)結合成免疫復合物才能發揮作用。長期酗酒，酒精會誘導NOX4的高表達，生成大量ROS，是導致肝細胞凋亡和壞死，肝星狀細胞激活的重要原因[6]。從乙醇灌胃誘導酒精性肝病的大鼠模型中分離出來的HSCs細胞中發現I型膠原和α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)表達的增加[7]。用乙醇誘導人或鼠的HSC細胞也會刺激α-SMA高表達[8]。

蟬翼藤為廣西民族特色中草藥，有較強的抗菌消炎、抗癌、增強免疫等療效[9]。甲基阿魏酸(methyl ferulic acid,MFA)是從蟬翼藤中提取的一種有機酸，本課題組前期研究[10]顯示MFA可抑制TGF-β1誘導的HSC細胞活化和增殖。該實驗以人肝星狀細胞(human hepatic stellate cells-LX2,HSC-LX2)為研究對象，研究MFA對乙醇誘導的HSC-LX2細胞干預作用，通過檢測HSC-LX2中NOX4、p22phox以及α-SMA的表達情況，ROS的含量變化情況來探討甲基阿魏酸抗肝纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人源性肝星狀細胞株HSC-LX2購自博慧斯(無錫)生物醫藥科技有限公司。

1.1.2主要儀器及試劑 MFA(批號：101236152)、MTT(批號：M2128)、DCFH-DA購自美國Sigma公司；CO2培養箱(型號：311)、高糖DMEM培養基、Hyclone胎牛血清購自美國Thermo公司；酶標儀(型號：ELX-800)購自美國BIO-RAD公司；RNA pure高純總RNA提取試劑盒、TIANS cript cDNA第一鏈合成試劑盒(北京TIANGEN公司)；乙醇、兔抗GAPDH單克隆抗體、鼠抗α-SMA單克隆抗體、兔抗NOX4單克隆抗體、兔抗p22phox單克隆抗體(上海生工公司)；普通ECL Plus發光液(北京泛博生化公司)；青霉素、鏈霉素(南通碧云天生物技術研究所)。α-SMA、p22phox、NOX4、β-actin引物(上海生工公司)，見表1。

表1 引物序列

1.2檢測指標和方法

1.2.1細胞培養和傳代 HSC-LX2用成分為10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養液培養，并置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，隔天換液。當顯微鏡下觀察細胞形態為單層的緊密狀態時，用EDTA-胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2MTT法檢測乙醇對HSC-LX2細胞的誘導作用 取對數生長期的HSC-LX2細胞接種于96孔板，1×104/孔，用含5～95 mmol/L乙醇的血清培養基分別培養0、1、3、6、12、24、48 h，MTT法檢測細胞存活率，并作圖分析。

1.2.3Western blot法檢測乙醇對HSC-LX2細胞最佳誘導時間 將HSC-LX2細胞以3×106接種于直徑為10 cm的培養皿中，將培養皿放入培養箱中培養至細胞生長狀態良好后，細胞分為正常對照組以及乙醇組。正常對照組細胞用不含乙醇的血清培養基培養。乙醇組用含50 mmol/L乙醇的血清培養基培養。0 h時，提取正常對照組的蛋白，BCA法測定蛋白含量，用Western blot法測定HSC-LX2細胞中GAPDH、α-SMA、p22phox以及NOX4蛋白表達。乙醇組細胞在分別培養1、3、6、12、24、48 h后，相同方法測GAPDH、α-SMA、p22phox以及NOX4蛋白表達。用Bio-Rad自動凝膠成像分析系統定量分析印跡。

1.2.4MTT法檢測MFA對HSC-LX2細胞的藥物毒性 取對數生長期的HSC-LX2細胞接種于96孔板，1×104/孔，放入培養箱中培養到細胞貼壁時，將細胞分為7組，并設置復孔，棄去原培養基，每孔分別加含有不同濃度MFA的含血清培養基200 μl(MFA濃度分別為100、200、300、400、500、600、700 mmol/L)，分別培養1、2、3 d，用MTT法檢測細胞抑制率，并作圖分析。

1.2.5MTT法檢測MFA對乙醇誘導HSC-LX2細胞的抑制作用 取對數生長期的HSC-LX2細胞接種于96孔板，1×104/孔，放入培養箱培養24 h后將細胞分為正常對照組、乙醇對照組和給藥組。給藥組分別加12.5、25、50、100、200、400 mmol/L的MFA，繼續培養24 h后，乙醇對照組和給藥組分別加50 mmol/L乙醇，培養20 h后，避光加MTT 20 μl，繼續培養4 h，棄去培養基，加二甲基亞砜(DMSO)150 μl，在室溫下放于搖床，低速振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長下測得吸光度(optical density,OD)值，重復3次取平均值。利用公式計算細胞抑制率并作圖分析不同濃度MFA對HSC-LX2細胞增殖的抑制作用。抑制率計算公式為細胞抑制率(%)= (對照組OD值-實驗組OD值) /對照組OD值×100%。

1.2.6MFA對乙醇誘導的LX-2細胞中ROS生成的影響 取對數生長期的HSC-LX2細胞接種于96孔板，1×104/孔，放入培養箱培養24 h后將細胞分為正常對照組、模型組和給藥組。給藥組分別加25、50和100 mmol/L的MFA，繼續培養24 h后，模型組和給藥組分別加50 mmol/L乙醇培養24 h后，加入DCFH-DA探針孵育30 min，將96孔板立即置于多功能酶標儀中檢測各孔熒光強度，激發波長和發射波長分別設定為485 nm和528 nm。

1.2.7RT-PCR法檢測HSC-LX2細胞相關 mRNA表達 將HSC-LX2細胞以3×106接種于直徑為10 cm的培養皿中，細胞分為正常對照組、模型組、MFA低劑量組、MFA中劑量組和MFA高劑量組。正常對照組僅含10%胎牛血清培養液，模型組含50 mmol/L乙醇，MFA低劑量組給予50 mmol/L乙醇+25 μmol/L MFA，MFA中劑量組給予50 mmol/L乙醇+50 μmol/L MFA，MFA高劑量組給予50 mmol/L乙醇+100 μmol/L MFA。細胞貼壁生長量好后，更換上述培養基培養24 h，收集細胞，按總RNA提取試劑盒的說明書，用TRIzol法提取HSC-LX2中總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量和純度。取5 μg RNA，用RNA逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。然后再進行PCR擴增，PCR反應總體積為20 μl，熱循環條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環后于72 ℃延伸5 min。反應結束后分別取10 μl擴增產物和DNA Marker上樣，進行瓊脂糖凝膠電泳，DNA帶進行觀察和紫外線燈拍攝。Bio-Rad自動凝膠成像分析系統檢測OD值，Quantity One軟件進行分析，以β-actin為參照物。

1.2.8Western blot法檢測HSC-LX2細胞相關蛋白表達 細胞分組同1.2.7，培養24 h后棄去培養皿中的上清液，冰上用生理鹽水清洗培養皿3次，加入RIPA裂解緩沖液裂解細胞，于冰上放置10 min使其充分裂解，收集細胞裂解物。在4 ℃離心機以12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定上清液中蛋白含量。取含100 μg總蛋白的上清液，加入5×buffer煮沸5 min后進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后把蛋白轉移到硝酸纖維膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，封閉結束后，用TBST溶液洗膜5 min，然后加入一抗[α-SMA一抗(1 ∶500)、NOX4一抗(1 ∶400)、p22phox一抗(1 ∶1 000)以及GAPDH一抗(1 ∶1 000)]孵育，4 ℃過夜。第二天用TBST洗膜4次，每次8 min，再與辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶8 000)作用1 h，TBST洗膜4次，每次8 min。在暗室用ECL發光液發光顯色。用Bio-Rad自動凝膠成像分析系統定量分析印跡。GAPDH蛋白用作內部對照。

2 結果

2.1不同濃度乙醇對HSC-LX2細胞的誘導作用不同濃度乙醇誘導HSC-LX2細胞48 h后，測得OD值，經計算得到細胞增殖率。結果表明，在作用48 h下，乙醇濃度在50 mmol/L 范圍內隨著時間增加細胞增殖率增加，乙醇濃度大于50 mmol/L 時細胞增殖率明顯下降，見圖1。

圖1 不同濃度乙醇對HSC-LX2細胞的誘導作用

2.2乙醇對HSC-LX2細胞中相關蛋白表達的影響HSC-LX2細胞經乙醇誘導48 h后，在各時間點提蛋白，Western blot檢測結果見圖2，在48 h內乙醇刺激HSC-LX2中α-SMA、p22phox和NOX4蛋白的高表達，且在24 h時作用更明顯，與0 h相比，差異有統計學意義(Fα-SMA=29.431、Fp22phox=57.172，FNOX4=39.034，P<0.05，P<0.01)。

2.3不同濃度MFA對HSC-LX2細胞的毒性作用不同濃度MFA對HSC-LX2細胞作用3 d后，測得OD值，經計算得到細胞抑制率，結果見圖3，MFA濃度在100～400 μmol/L內，隨著作用時間增加細胞抑制率變化幅度不大，說明這一范圍內MFA毒性作用小，所以選取MFA濃度在400 μmol/L之內進行以下實驗。

2.4不同濃度MFA對乙醇誘導HSC-LX2細胞增殖的抑制作用不同濃度的MFA對乙醇誘導HSC-LX2細胞干預后，測得OD值，經計算得到細胞抑制率，結果表明，MFA濃度在100 mmol/L以內，隨著濃度的增加，抑制率增加；而濃度大于100 mmol/L時抑制率反而下降，因此選擇25、50和100 mmol/L作為藥物MFA低、中和高濃度進行后續實驗(F=24.902，P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 不同濃度MFA對乙醇誘導HSC-LX2的抑制率比較

2.5MFA對HSC-LX2細胞中ROS生成的影響不同濃度的MFA對乙醇誘導HSC-LX2細胞干預后，加入DCFH-DA探針孵育30 min，測各孔熒光強度，結果顯示乙醇刺激HSC-LX2中ROS含量顯著增加，MFA能減弱ROS生成，與模型組相比差異有統計學意義，且高劑量作用效果更明顯，差異有統計學意義(F=43.853，P<0.05，P<0.01)。見圖4。

2.6MFA對HSC-LX2細胞中相關mRNA表達的影響MFA和乙醇作用于HSC-LX2細胞24 h后，收集細胞，提取RNA，RT-PCR結果顯示乙醇刺激HSC-LX2中α-SMA、NOX4和p22phoxmRNA高表達，MFA干預后降低細胞中α-SMA、NOX4和p22phoxmRNA表達，高劑量作用效果更顯著，差異有統計學意義(Fα-SMA=137.428，Fp22phox=59.417，FNOX4=63.538，P<0.05)。見圖5。

圖2 乙醇作用于HSC-LX2 48 h內α-SMA、p22phox、NOX4和GAPDH蛋白表達

圖3 不同濃度MFA對HSX-LX2細胞的毒性作用

2.7MFA對HSC-LX2細胞中蛋白表達的影響經MFA和乙醇誘導HSC-LX2細胞24 h后，Western blot法檢測α-SMA、NOX4和p22phox蛋白表達，結果顯示，模型組中α-SMA蛋白表達量與正常對照組比較顯著增加，同時模型組中NOX4和p22phox表達與正常對照組相比，蛋白表達量均明顯增加。藥物干預后α-SMA、NOX4和p22phox蛋白表達量均顯著下降，高劑量組抑制作用更明顯，差異有統計學意義(Fα-SMA=62.530，FNOX4=45.937，Fp22phox=34.714，P<0.05)。見圖6。

3 討論

酒精性肝纖維化是嚴重危害公共衛生的最常見疾病之一，其發病率呈逐年上升趨勢[11]。雖然近年來關于酒精性肝纖維化的研究已經取得很大進展，但尚未有令人滿意的治療方法。本課題從HSC-LX2的增殖和活化這一角度出發，研究甲基阿魏酸抑制肝纖維化的作用機制。

HSC是肝臟分泌ECM的主要細胞，在肝纖維化的發展機制中占有重要的地位，備受人們關注[12]?；罨腍SC伴隨著維生素A的儲存損失和細胞骨架蛋白的上調表達如α-SMA和結合蛋白[13]。因此α-SMA被認為是HSC活化的重要標志之一。NOX4可誘導ROS過表達進而激活HSC，而過量乙醇會導致NOX4的高表達，即乙醇可通過誘導NOX4過表達進而誘導ROS高表達、激活HSC。本實驗通過MTT法和Western blot法測得乙醇誘導HSC-LX2細胞的最佳濃度和作用時間點。乙醇濃度在5～50 mmol/L范圍內，隨著時間推移，乙醇誘導HSC-LX2增殖，細胞存活率逐漸增加，當乙醇濃度大于50 mmol/L時，HSC-LX2細胞存活率反而隨著時間的增加而降低。經乙醇誘導HSC-LX2細胞后，α-SMA、p22phox和NOX4蛋白表達水平在24 h內隨著作用時間增加而逐漸增加，24 h達到最大表達量,反而乙醇作用48 h時，相關蛋白表達含量均低于24 h的表達量，呈下降趨勢。說明乙醇誘導HSC-LX2細胞24 h時，對HSC-LX2作用最強。因此，選取濃度為50 mmol/L乙醇誘導HSC-LX2細胞24 h作為模型展開實驗。

圖4 MFA對乙醇誘導HSC-LX2細胞中ROS生成的影響

圖5 MFA作用下各組HSC-LX2的α-SMA、NOX4和p22phox mRNA表達

圖6 MFA作用下各組HSC-LX2細胞中相關蛋白表達

MFA是從蟬翼藤中提取的一種化合物，課題組前期研究[14]顯示MFA通過抑制大鼠HSC的增殖而減少ECM的合成，從而抑制大鼠肝纖維化。本實驗通過MTT法來檢測不同濃度MFA對HSC-LX2的毒性作用。MFA濃度為100～400 μmol/L時，細胞的存活率在90%以上，上下波動幅度不大，表明 當MFA濃度低于400 μmol/L時對HSC-LX2細胞無毒性作用。在400 μmol/L以內選取7個濃度梯度干預酒精誘導HSC-LX2，當MFA濃度小于100 μmol/L時，HSC-LX2生長的抑制率呈劑量依賴式增加；當藥物濃度大于100 μmol/L時，細胞生長的抑制率反而不斷下降。MFA濃度為100 μmol/L時，抑制作用達到最大化(P<0.01)。因此，選取25、50、100 μmol/L分別作為MFA低、中、高劑量組的濃度。

在MFA干預經乙醇誘導HSC-LX2細胞后，經過熒光酶標儀檢測細胞中ROS表達，模型組與正常對照組相比，熒光密度顯著增加，說明乙醇可誘導ROS高表達，進而活化HSC-LX2。MFA干預后，藥物組HSC-LX2中的熒光密度與模型組相比，均顯著減弱，說明MFA可抑制ROS的表達，從而抑制HSC活化。RT-PCR法和Western blot法分別檢測HSC-LX2細胞中NOX4、p22phox和α-SMA的mRNA和蛋白表達。結果顯示：與正常對照組相比，模型組中α-SMA的mRNA及蛋白表達均顯著增加，說明乙醇可誘導HSC-LX2細胞活化。給藥組的NOX4和p22phox的mRNA及蛋白表達較模型組相比均顯著下降，且呈劑量依賴式下降。表明MFA可通過抑制NOX4和p22phox來減弱HSC-LX2活化及增殖。

綜上所述，MFA可通過抑制α-SMA的表達進而抑制HSC-LX2活化和增殖， MFA也通過減弱乙醇誘導的NOX4和p22phox高表達，進而減弱HSC-LX2細胞中ROS生成達到抑制HSC-LX2活化的效果。由于HSC-LX2的活化可直接導致肝纖維化的發生，我們推測MFA有抑制肝纖維化發展的作用，但其是否通過直接抑制NOX4、p22phox和α-SMA來發揮抗肝纖維化作用，還有待進一步研究。

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