TSG-6調控PI3K/Akt-Bcl-2通路影響人瘢痕疙瘩凋亡機制的研究

田小雨，李小靜，李心怡,李 濤

瘢痕疙瘩是由皮膚傷害和刺激造成的，其形成過程中人瘢痕疙瘩成纖維(human keloid fibroblast,HKF)細胞數量不斷增多、凋亡減少是瘢痕不斷增生的細胞學基礎之一[1]。前期課題組研究[2]證實腫瘤壞死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6，TSG-6 )mRNA及蛋白表達在病理性瘢痕組織中比瘢痕周圍正常皮膚明顯降低，差異有統計學意義。Tan et al[3]以無瘢痕愈合皮膚作對照組，發現瘢痕疙瘩中TSG-6表達水平明顯降低，推測無瘢痕皮膚愈合可能與TSG-6蛋白大量表達相關。綜上，誘導病理性瘢痕形成的因素之一可能是TSG-6蛋白表達不足。TSG-6的大量表達可以有效抑制病理性瘢痕形成，但作用機制尚不完全明確。該實驗旨在進一步探討TSG-6是否通過負向調控3-磷酸肌醇激酶/絲/蘇氨酸蛋白激酶-B淋巴細胞瘤-2基因(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B-B cell lymphoma-2，PI3K/Akt-Bcl-2)促進HKF凋亡而抑制瘢痕疙瘩增生。

1 材料與方法

1.1材料8例組織標本來自安徽醫科大學第一附屬醫院整形外科門診、住院患者明確診斷，手術切除棄用的典型瘢痕疙瘩。取材標本術前均未接受藥物及其他治療且均獲得本人或其監護人同意。質粒載體pLVX-puro和pLVX-shRNA1購自美國Clontech公司，由安徽醫科大學微生物教研室提供大腸桿菌DH5a和293T細胞。

1.2主要試劑Transcriptor First Strand cDNA Syn-thesis Kit購自瑞士Roche公司；Trizol、Lipofectamine 2000購自美國Life Technologies公司；One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自大連寶生物TAKARA工程有限公司；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；Annexin V凋亡檢測試劑盒及兔抗人PI3K、AKT、鼠雙微基因2(murine double minute 2，MDM2)、P53、Bcl-2抗體均購自英國Abcam公司。

1.3實驗方法

1.3.1HKF的原代培養及鑒定 手術取得標本后加入配置好的IV型膠原酶溶液，于37 ℃恒溫振蕩器震蕩10 h消化標本，將HKF接種至細胞培養瓶，培養3～5 d觀察細胞貼壁率達75%以上傳代。細胞傳至第3代時進行實驗。

1.3.2構建重組慢病毒表達載體pLVX-pour-TSG-6及干擾載體pLVX-shRNA1-TSG-6 參考GenBank中TSG-6全基因擴增引物，設計上游引物為[4]：5′-GGAATTCATGATCATCTTAATTTACT-3′，下游引物為：5′-CGGGATCCTAAGTGGCTAAATC-3′。 提取HKF總RNA，逆轉錄成cDNA行PCR擴增。將成功擴增的PCR產物和pLVX-Puro行雙酶切。再設計TSG-6干擾載體序列后設計互補序列并使之形成雙鏈DNA片段行雙酶切。擴增培養陽性克隆，依據無內毒素質粒提取試劑盒說明書提取質粒備用。

1.3.3慢病毒包裝及轉染、細胞分組 制備攜帶pLVX-Puro-TSG-6質粒的慢病毒。48 h后檢測慢病毒滴度，-80 ℃凍存。同樣方法將pLVX-Puro空質粒、pLVX-shRNA1-TSG-6、pLVX-shRNA1空質粒用慢病毒包裝，檢測后-80 ℃凍存。HKF細胞胰酶消化后接種，24 h后加入各組病毒液繼續培養。1周后再感染一次，48 h后篩選。得TSG-6過表達組、TSG-6干擾組、過表達對照組、干擾對照組。提取RNA、蛋白行PCR及Western blot方法檢測表達水平。

1.3.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞，加75%乙醇4 ℃固定24 h，調整細胞濃度為1×106/ml,配置Annexin V標記液和Binding Buffer，避光室溫孵育15 min后加PI，余組處理同前。15～30 min內用流式細胞儀完成檢測。細胞凋亡率(%)=(凋亡細胞數/正常細胞數)×100%。

1.3.5CCK-8法檢測各組細胞增殖能力 調整各組細胞濃度至1×104個/ml，向96孔板每孔加入0.1 ml細胞懸液和10 μl CCK-8混勻后，培養0、24、48、72、96 h后在酶標儀上檢測在450 nm波長下各組細胞的吸光度。以空白孔為對照，周圍以PBS作為濕化孔，每個時間點檢測6個復孔，實驗重復三次取平均值。

1.3.6RT-PCR 提取各組總RNA，用表1中引物行PCR擴增。采用日本TAKARA公司One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)試劑盒，按說明書操作，反應條件為95 ℃、45 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環。每個樣品做3個復孔。

1.3.7Western blot 采用RIPA裂解液法提取各組細胞蛋白并采用BCA試劑盒經酶標儀檢測后計算出蛋白濃度，經SDS-PAGE法電泳后轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用相應的一抗4 ℃孵育過夜；再經二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，ECL顯色，在化學發光成像系統中拍攝照片。β-actin做內參。

表1 RT-PCR檢測所用的引物

2 結果

2.1TSG-6對HKF細胞凋亡的影響流式細胞術分析細胞凋亡情況：HKF組、過表達對照組、干擾對照組、TSG-6過表達組、TSG-6干擾組的細胞凋亡比例分別為12.57%、13.60%、13.00%、22.23%、8.13%。上調TSG-6基因對細胞凋亡有明顯的促進作用。與HKF組對比，TSG-6過表達組的細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；TSG-6干擾組結果則相反(P<0.05)；過表達對照組、干擾對照組、HKF組間差異無統計學意義。見圖1。

2.2TSG-6對HKF細胞增殖能力的影響對各組細胞培養0、24、48、72、96 h后觀察，上調TSG-6基因的表達對細胞增殖有顯著抑制作用。與HKF組比較，TSG-6過表達組的細胞增殖顯著減緩(P<0.05)；TSG-6干擾組細胞增殖效應顯著升高(P<0.05)；過表達對照組、干擾對照組、HKF組間差異無統計學意義。見圖2。

2.3TSG-6對HKF細胞PI3K/Akt-Bcl-2信號通路的影響與HKF組相比，TSG-6過表達組PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2明顯降低,P53顯著升高(P<0.05)；與HKF組相比，TSG-6干擾組PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2顯著升高,P53明顯降低(P<0.05)；過表達對照組、干擾對照組、HKF組間差異無意義，見圖3、4。

3 討論

圖1 流式細胞術檢測細胞凋亡

A：HKF組；B：過表達對照組；C：干擾對照組；D：TSG-6過表達組；E：TSG-6干擾組；F：各組細胞凋亡百分比比較;與HKF組比較：*P<0.05

圖2 CCK-8法檢測各組細胞增殖能力

圖3 RT-PCR檢測PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2、P53的mRNA表達

圖4 Western blot檢測PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2、P53表達

瘢痕疙瘩又稱為結締組織增生癥，是創面愈合后所形成的過度生長的異常瘢痕組織。病理性瘢痕所致的外觀及功能障礙嚴重影響患者身心健康和生活質量，目前無滿意治療方案。組織學研究[5-6]顯示：HKF增殖加快，進入非正常凋亡途徑，因此，治療病理性瘢痕的關鍵之一即使HKF增殖減緩或凋亡增快。相關研究證實，PI3K/Akt通路在所有哺乳動物細胞中存在[7]，并促進HKF增殖[8]。TSG-6基因是在篩選腫瘤壞死因子α干預的人成纖維細胞cDNA表達文庫時首次發現的，在人體內編碼為TNFAIP6基因，該基因是一種有透明質酸結合的鏈域a，其編碼的蛋白包含277個氨基酸，是30 ku的分泌蛋白[9]。隨著研究的不斷深入，已證實該基因在正常皮膚成纖維細胞中無表達，若在炎性因子的刺激下，TSG-6蛋白在成纖維細胞中的表達會增加。本實驗構建TSG-6慢病毒表達、干擾載體及其對應空質粒載體并轉染HKF，觀察瘢痕疙瘩形成過程中TSG-6對成纖維細胞增殖和凋亡的相關性，結果顯示與HKF相比，TSG-6過表達組細胞增殖減緩，凋亡率顯著升高；TSG-6干擾組則相反；余組間差異無統計意義。RT-PCR、Western blot檢測顯示TSG-6過表達組抑制PI3K、Akt、MDM2、Bcl-2表達,促進P53表達。TSG-6干擾組促進PI3K、Akt、MDM2、Bcl-2表達,抑制P53表達；余組間差異無統計意義。

課題組前期實驗研究[9]證實：TSG-6提高HKF的凋亡率效果顯著。本實驗運用不同方法更充分地證實這一結論。相關研究[10]證實，在兔角膜損傷模型中，將重組人TSG-6蛋白在創傷早期應用于損傷部位，可抑制白介素-6 、白介素-1β的表達及中性粒細胞浸潤。在小鼠關節炎模型中，TSG-6蛋白可促使炎癥局部化并減輕關節水腫和軟骨、骨質損害[11]。TSG-6在結膜松弛癥中也對結膜基質層及Tenon囊細胞凋亡有促進作用[12]。PI3K/Akt-Bcl-2通路在維持細胞正常生理功能中起到及其關鍵作用[13]。Bcl-2蛋白是B淋巴細胞瘤-2原癌基因的編碼產物，是一種內膜蛋白，有關Bcl-2基因在腫瘤細胞中表達的研究較多，多項實驗研究均證實其在腫瘤細胞中超正常高表達，提示該基因有抑制凋亡作用。在兔耳瘢痕模型實驗中，采用免疫組織化學方法檢測正常皮膚與瘢痕組織時，觀察到Bcl-2蛋白在瘢痕組織中的表達陽性率明顯更高，提示Bcl-2的抗凋亡作用可能與瘢痕組織中成纖維細胞富集存在關聯，但具體機制不明確[14]。本實驗顯示TSG-6過表達組與HKF組相比，PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2 mRNA及蛋白的表達量明顯降低,P53顯著升高；TSG-6干擾組則相反。而HKF組、過表達對照組以及干擾對照組組間差異無統計學意義。相關研究[15]證實PI3K被激活后，間接激活AKT， 增加其下游分子MDM2、Bcl-2的表達而抑制P53的表達。而在此實驗中TSG-6作用于HKF降低了PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2的蛋白表達，上調P53蛋白表達量。本實驗提示，TSG-6在影響HKF增殖與凋亡的過程與PI3K/Akt-Bcl-2途徑相關。調控細胞凋亡的多條途徑是相互交織、互相關聯的，而TSG-6本身具有多種誘導調控功能，且瘢痕的發生發展與皮膚損害密不可分，相關研究[16]已證實在瘢痕形成過程中NF-κB等通路也有參與，但是否與這些通路之間具有協同作用，還有待進一步研究。

參考文獻

[1] Ogawa R.Keloid and hypertrophic scars are the result of chronic inflammation in the reticular dermis[J].Int Mol Sci,2017,18(3): E606.

[2] 洪學哲,李小靜,寧金龍.TSG-6在病理性瘢痕中的表達及意義[J].安徽醫科大學學報,2013,48(6):685-7.

[3] Tan K T,McGrouther D A,Day A J,et al.Characterization of hyaluronan and TSG-6 in skin scarring: differential distribution in keloid scars, normal scars and unscarred skin[J]. Eur Acad Dermatol Venereol,2011,25(3):17-27.

[4] Gauglitz G G, Korting H C, Pavicic T,et al. Hypertrophic scarring and keloids: pathomechanisms and current and emerging treatment strategies[J]. Mol Med, 2011, 17(1-2):113-25.

[5] van der Veer W M,Bloemen M C,Ulrich M M, et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation[J]. Burns, 2009，35(1): 15-29.

[6] Kim E H,Suresh M.Role of PI3K/Akt signaling in memory CD8 T cell differentiation[J].Front Immunol,2013,4:20.

[7] 劉劍毅,李世榮.PI3K/Akt信號通路與結締組織生長因子促人增生性瘢痕纖維化[J].重慶醫學,2008,37(9):920-1.

[8] Wang H,Chen Z,Li X,et al.TSG-6 treatment promoted apoptosis in human fibroblasts of pathological scar[J].Cell Molr Biol (Noisy-le-qrand),2016,62(6):33-7.

[9] Oh J Y,Roddy G W,Choi H,et al.Anti-inflammatory protien TSG-6 reduces inflammatory damage to the comea following chemical and mechanical injury.[J]Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(39):16875-80.

[10] Bárdos T,Kamath R V,Mikecz K,et al. Anti-fnflammatory and chondroprotective effect of TSG-6 (tumor necrosis factor-alpha-stimulated gene-6)in murine models of experimental arthritis[J].Am J Pathol,2001,159(5):1711-21.

[11] Guo P,Zhang S Z,He H,et al.TSG-6 controls transcription and activation of matrix metalloproteinase 1 in conjunctivochalasis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(3):1372-80.

[12] 慕生枝,孫要文,王國棟.下調miR-21通過PDCD4抑制人增生性瘢痕成纖維細胞增殖并抑制PI3K/Akt信號通路[J].中國美容醫學,2015,24(23):39-43.

[13] Wang H,Chen Z,Li X J,et al.Anti-inflammatory cytokine TSG-6 inhibits hypertrophic scar formation in a rabbit ear model[J].Eur J Pharmacol,2015,751:42-9.

[14] Hers I,Vincent E E,Tavaré J M,Akt signalling in health and disease[J].Cell Signal,2011,23(10):1515-27.

[15] 王佳妮,李小靜,李 濤,等.TSG-6促進瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡及其NF-κB信號通路影響的實驗研究[J].安徽醫科大學學報,2017,52(9):1266-70.