7種非洲多發病毒病基于熒光微球的多元核酸檢測方法的建立與初步評價

閆芳域 殷強玲 李阿茜 蕪為 李川 梁米芳 李德新 李建東

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

隨著全球經濟一體化及現代交通運輸方式的快速發展，傳染病跨境傳播的風險不斷加大。多種危害嚴重的重要傳染病，如埃博拉(ebola virus disease， EVD)、馬爾堡(marburg virus disease, MVD)、黃熱病(yellow fever, YF)、拉沙熱 (lassa fever, LF)、克里米亞-剛果出血熱病毒(crimean-congo hemorrhagic fever, CCHF)、裂谷熱(rift valley fever, RVF)、基孔肯雅熱(chikungunya fever, CHIK)等均源于非洲[1-3]。我國與非洲交往日益增多，非洲重要病毒病存在輸入國內的風險。本研究針對在非洲高發且具有嚴重公共衛生危害的重要病毒病，以Luminex微流系統為平臺，建立基于熒光微球的核酸多元檢測方法，并完成了初步的評價。

1 材料與方法

1.1材料RVFV、 CCHFV、MARV、 ZEBOV、LASV的N、GP基因，和CHIKV的E1基因和YFV NS5基因由公司化學合成。xMAP熒光微球購自Bio-Rad公司，1.2 μm的96孔濾模板購自Millipore公司。

1.2引物和探針應用Primer Express 3.0(美國Thermo公司)設計引物和探針，并用primer-BLAST驗證特異性。在探針5′端進行12個碳原子連接臂的氨基修飾以偶聯微球。在反向通用引物的5′端引入生物素標記。

1.3參考品及模擬樣本制備使用帶有T7啟動子序列的引物，擴增上述病毒基因序列，作為模板，采用RiboMAX large scale RNA production systems SP6/T7 kit (美國Promega公司) 進行體外轉錄。DNase I進行消化后，使用RNeasy Mini Kit(德國Qiagen公司) 進行純化。并用Nano drop和凝膠電泳的方法進行定量。

1.4基于熒光微球的核酸檢測檢測過程包括熒光微球與探針偶聯、樣本核酸提取、多重PCR擴增、雜交檢測等過程。

1.4.1 熒光微球與探針偶聯：參照試劑盒說明書，使用EDC(美國Thermo公司)將氨基修飾的探針和羧基修飾的微球在室溫避光條件下偶聯，微球避光儲存于4 ℃條件。

1.4.2 PCR擴增：采用One Step RT-PCR kit試劑盒(德國Qiagen公司)進行Tem-PCR擴增[7]，分為5個階段，①反轉錄50 ℃ 30 min, ②熱啟動95 ℃ 10 min, ③加標簽 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min共10個循環，④大規模擴增 95 ℃ 30 s, 48℃1 min, 72℃1 min共30個循環。⑤延伸 72 ℃ 7 min。

1.4.3 雜交檢測： 一個反應體系中包括33 μl 1.5×TMAC微球溶液，約含有5 000個熒光微球，10 μlTris-EDTA溶液(pH=8.0)，7 μl多重PCR產物。設置3個復孔，在95 ℃ 3 min；50℃30 min條件下孵育。產物移入被鞘液潤濕的在50 ℃條件下預熱的96孔濾模板中，真空泵抽濾，加入100 μl，1.5×TMAC溶液，輕微震蕩后真空泵抽濾，加入使用1×TMAC溶液稀釋的3 μg/ml的鏈霉親和素-藻紅素(美國Prozyme公司)溶液，50 ℃條件下避光孵育10～5 min。真空泵抽濾后加入100 μl 1.5×TMAC使用Luminex Calibrate Kit(美國Bio-Rad公司)調試Luminex Bioplex 200，按照操作手冊上機檢測讀值，并以熒光中位值(Median fluorescence intensity, MFI) ≥陰性對照均值+3倍標準差為陽性判定標準。

1.5檢測限、特異性及穩定性評價對RNA參考品進行10倍系列稀釋，達到101～108拷貝/ μl，評價檢測限并與Real-time PCR方法對比。分別選取105和107拷貝/μl的參考品，重復實驗3次，每次設置3個復孔，計算其組內和組間變異系數，評價穩定性。選用30份ZIKA、DENV和SEOV病毒等疑似病例樣本、7種病毒核酸模擬樣本及32份正常人血清樣本評價方法的特異性。

2 結果

2.1引物和探針設計引物、探針模擬驗證后，采用Tem-PCR原理[4]，在正反向引物5′末端添加通用引物(表1)，實現靶基因片段多重擴增的。

2.2參考品制備以公式RNA濃度(拷貝/ μl)=濃度(g/ μl) ×6.02×1023/轉錄片段長度(核糖核酸數量)×340計算出參考品濃度。定量之后10倍系列稀釋，獲得101-108拷貝的體外轉錄產物。

2.3檢測限利用10倍系列稀釋的RNA參考品分別進行單重和7重的核酸檢測， 繪制檢測曲線(圖1)，與Real-time PCR方法的檢出限對比 (表2)。

2.4特異性選取108拷貝/ μl 7種病毒的的RNA為模擬樣本，進行交叉反應檢驗，結果顯示7種病原體之間無明顯非特異性交叉反應；對30份寨卡病毒(Zika virus, ZIKA)、登革病毒(Dengue virus, DENV)和漢城病毒(Seoul virus, SEOV)的模擬患者標本、32份健康人血清標本進行檢測，特異性為100%(圖2)。

2.5穩定性對濃度為105拷貝/ μl和107拷貝/ μl 的7種病原靶基因參考品進行3次重復性檢測，結果顯示組內變異系數均小于12%，組間變異系數均小于15%，經方差分析P>0.11，組內組間測量值統計學差異無統計學意義，(圖3)。

A:RVFV; B: YFV; C:MARV; D:ZEBOV; E:LASV; F:CCHFV; G: CHIKV圖1 不同濃度病毒RNA多重檢測曲線Fig.1 Multiplex detection curves of viral RNA under different concentration

圖2 基于熒光微球的核酸檢測方法的特異性評價Fig.2 Evaluation of specificity of the fluorescent bead-based multiplex PCR assay

A: 樣本濃度為107拷貝/ μl; B: 樣本濃度為105拷貝/ μl圖3 基于熒光微球的核酸檢測方法的穩定性評價A: Sample concentration at 107copies/ μl; B: Sample concentration at 105copies/ μlFig.3 Evaluation of the reproducibility of the fluorescent bead-based multiplex PCR assay

3 討論

隨著航空業的快速發展，國家間經貿合作交流的增加，傳染病跨界傳播的風險不斷加大。2016年，安格拉黃熱疫情暴發，中國報道了11例輸入性病例[5]。2014年，西非埃博拉疫情大暴發，病例傳入美國、英國等國家，并在尼日利亞，剛果引發暴發疫情[6]。登革熱、基孔肯雅熱、黃熱等蟲媒傳染病，均不斷發生跨境傳播，引起全球范圍的流行[7]。

表1 七種非洲地區多發病毒病核酸檢測引物與探針序列Tab.1 The primers and probes of seven viral diseases with a high incidence in Africa

*：本研究中所用探針均在5′端偶聯12個碳原子，充當連接臂，并進行氨基修飾，以便偶聯到熒光微球表面

*: All the probes in this research are coupled with 12 C atoms at 5′ end as a link arm and were amino-modified to connect to the surface of the fluorescent beads

目前，病毒病的實驗室檢測方法主要包括檢測病毒抗體的血清學檢測方法，檢測病毒抗原、核酸以及分離病毒等病原學檢測方法。Real-time PCR方法經濟、簡單、方便，廣泛用于特定病原體檢測、監測或常見病的檢測，但由于通量的限制，難以用于罕見病原體的篩查。Luminex等基于熒光微球的核酸檢測平臺利用微球和不同熒光編碼技術，可以針對少量樣本開展高通量檢測。在血清學特異性抗體檢測中，由于整個檢測過程均在液相中進行，增加了反應接觸面積和幾率，較經典ELISA反應具備更高的敏感性和特異性[8-9]。基于該項技術的核酸檢測方法，在國內、外也開展相關研究，主要集中在呼吸道病毒和腸道病毒的組合檢測中，臨床樣本檢出率可達80%～100%，針對呼吸道病毒的商業化試劑盒，檢測限約為10-1TCID50，特異性為95%～100%[10]。

表2 單重和多重檢測及Real-time PCR的敏感性分析

Tab.2Analytical sensitivity of single and multiple test and real-time PCR

本研究中建立的7種非洲地方性流行的病毒病多元檢測方法包括樣本核酸提取、核酸特異性擴增富集、分子雜交和基于熒光微球的檢測4個模塊，為了增加反應的靈敏性，分模塊對反應體系進行優化，檢出限約為102-5拷貝/ μl，為可能輸入的重要傳染病檢測提供新的手段和方法。基于熒光編碼微球的檢測技術，反應物在液相間相互作用，與自然狀態下的作用環境相似，有助于提升檢測的敏感性和特異性。同時，隨著編碼技術和微流系統的改進以及檢測過程的不斷優化，基于熒光微球的檢測技術將得到更廣泛的應用。

利益沖突:無

參考文獻

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