輪狀病毒P[6]基因型毒株LL4260株的VP8*核心區蛋白的表達和純化

王璐瑤 李丹地 孫曉曼 章青 王宏 龐立麗 胡繼宏 段招軍

730000 蘭州，甘肅中醫藥大學公共衛生學院(王璐瑤、胡繼宏); 102206 北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(李丹地、孫曉曼、章青、王宏、龐立麗、段招軍)

輪狀病毒(Rotaviruses，RVs)是引起5歲以下兒童重癥腹瀉的主要原因，世界范圍內因RV腹瀉每年約13 000萬嬰幼兒到醫院就診，200萬例住院，約50萬嬰幼兒死亡[1]。RV感染嚴重威脅著人類健康并造成了巨大影響，給公共衛生帶來了很大的威脅[2]。

輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，其基因組由11個雙鏈RNA節段組成，分別編碼6種結構蛋白(VP1～VP4，VP6，VP7)和6種非結構蛋白(NSP1～NSP6)。在病毒侵入細胞過程中，VP4經胰蛋白酶切割后裂解為VP5*和VP8*[3-4]，VP5*主要促進病毒進入細胞質。而VP8*是VP4的遠端，參與病毒與受體彼此作用，介導病毒作用宿主細胞，因此，VP8*蛋白在病毒感染中具有重要的生物學和免疫學功能[5-6]。而病毒主要依賴于宿主細胞表面的特異性受體的識別來進行感染，因此受體是病毒感染宿主細胞的重要因素[7]。目前發現，僅少數動物RV是唾液酸(sialic acid，SA)敏感型毒株，可以識別細胞表面的唾液酸受體而吸附到宿主細胞上；而許多人類RV的重組VP8*蛋白可以識別人血型組織抗原(histo-blood group antigens，HBGAs)感染宿主[8]，HBGAs是一類復合糖，廣泛存在于呼吸道、生殖器和消化道的黏膜上皮細胞表面，也以游離低聚糖的形式存在于體液如唾液、腸內容物、乳汁和血液中，可作為某些病原微生物的糖類受體被識別，與一些感染性疾病的易感性有關[9-10]。HBGAs作為RV結合受體的發現是輪狀病毒研究領域的重大突破，通過RV 與HBGAs相互作用的研究將有助于了解RV的宿主適應性及病毒進化和流行的規律。雖然已有研究顯示通過寡糖和唾液結合實驗，部分P[4]、P[6]、P[8]型RV的VP8*可與HBGAs結合，且不同P基因型的RV識別的HBGAs抗原也不盡相同[11]，因此，這表明HBGAs-RV之間的結合模式以及各基因型結合的特異性還有待于進一步的研究。為研究其受體結合特性，本研究通過P[6]基因型輪狀病毒株LL4260毒株VP8*蛋白在大腸埃希菌系統中的表達，為進一步研究受體結合共性以及結構特點提供基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料卡那霉素購自美國Sigma公司；限制性內切酶Xho I和Nde I、cutsmart、DNA marker、T4連接酶購買于TaKaRa公司；克隆載體pET30α為本實驗保存；感受態細胞購置于自天根生物公司；LL4260毒株VP8*全長基因質粒為本實驗室保存；HistrapH和superdex20010/300GL純化柱購自GE Heahhcare公司。

1.2實驗方法

1.2.1 引物合成：LL4260全長基因用核心區引物NdeI(5′-GGAATTCCATATGGTGTTGGATGGACC-3′)和XhoI(5′-CCGCTCGAGTAATCCATTATTTACGTATTC-3′)擴增LL4260 VP8*核心區片段。

1.2.2 克隆構建：將PCR擴增的核心區片段用限制性內切酶NdeI、XhoI進行雙酶切后與用同樣酶雙酶切的pET30a載體16 ℃連接過夜，而后轉入DH5α感受態細胞，37 ℃過夜，挑單克隆搖菌后進行質粒提取，質粒送天一輝遠公司測序，序列正確的質粒保留備用。

1.2.3 蛋白表達和純化：陽性質粒轉化BL21感受態中，過夜(37 ℃)，挑取單克隆到含有卡那霉素的LB瓶中過夜震蕩，取15 ml轉接到1.5 L 的含卡那霉素的LB培養基中以溫度37 ℃、離心力180 g中培養約3.5 h，使OD600到達0.637，將溫度調整到22 ℃，加IPTG(使得終濃度達0.4 mmol/L)，以22 ℃，150 g誘導培養過夜。第2天收菌，1xPBS重懸，冰浴用80%功率超聲，再將超聲后的破碎液用高速離心機(13 000×g，4 ℃)離心60 min，得到的上清即為可溶性表達的VP8蛋白。收集上清用濾膜過濾后過HistrapHP柱，用濾膜過濾過的H2O、PBS、20 mmol/L咪唑、50 mmol/L咪唑、300 mmol/L咪唑緩沖液各沖洗30 ml。用各濃度的洗脫液進行聚丙烯酰氨凝膠(SDS—PAGE)電泳，經過考馬斯亮藍染色與水煮脫色。可以檢測出所需要的蛋白的目的條帶。

1.2.4 分子篩層析：將鑒定好的目的蛋白用超速離心管按照3000×g離心濃縮到1.0 ml左右，吸出備用；先用已過濾好的水平衡superdex 200 s柱子，再用20/50(20 mmol/L Tris和50 mmol/L NaCl,pH=8.0)的緩沖液均衡一個柱體積。將濃縮的樣品用上樣環上樣后進行分子篩層析，根據UV280 nm的吸收值收集樣品，根據所得的峰值以及收集得到樣品的SDS-PAGE電泳結果來分析蛋白。

2 結果

2.1基因擴增和克隆構建利用核心區引物PCR擴增得到LL4260 VP8*core基因片段500 bp)。通過酶切連接，構建得到pET30 a-LL4260VP8*core克隆，挑取單克隆提取質粒送測序，測序正確后保留備用。

2.2蛋白表達重組質粒pET30 a-LL4260VP8*core轉化BL21感受態細胞。經IPTG誘導表達蛋白。通過HistrapHP柱進行親和層析，并用不同濃度的咪唑洗脫液洗蛋白。結果表明通過50和300 mmol/L咪唑均可洗脫得到目的蛋白，但是300 mmol/L洗脫的純度較高，而50 mmol/L的量較大。如圖1所示。

圖1 LL4260 VP8*核心區蛋白純化1、2、3和4分別是PBS、20 mmol/L、50 mmol/L、300 mmol/L咪唑洗脫的樣品Fig.1 The purification of LL4260 VP8*core proteins．1，2，3 and 4 refer to the elution of PBS，20 mmol/L，50 mmol/L and 300 mmol/L imidazole buffer

2.3蛋白純化蛋白在超濾管濃縮后，通過superdex20010/300GL柱進行分子篩，從而進一步進行蛋白純化，結果顯示蛋白在大約18 ml左右開始出峰，而SDS-PAGE顯示蛋白相對分子質量為22×103左右，純度可達到85%以上，如圖2所示。

圖2 LL4260 VP8*核心區蛋白分子篩層析結果：圖中橫軸代表樣品出峰的位置(單位為ml)，縱軸代表樣品在280 nm處的UV吸收值Fig.2 The gel filtration results of pET30 a-LL4260VP8*core proteins. The horizontal axis refers to the position of the protein peak (the unit is milliliter). The vertical axis refers to the absorbance at UV 280 nm

3 討論

輪狀病毒引起的急性腸胃炎是兒童腹瀉中高致病率的重要病因，目前缺乏有效的治療措施，疫苗是控制輪狀病毒感染的唯一有效措施。VP8*蛋白是病毒吸附進入宿主細胞的功能性蛋白，在病毒與宿主細胞互相作用中起重要作用。感染人的最常見VP4*基因型為P[4]、P[6]、P[8]，3個主要P基因型占所有輪狀病毒的99%[12]。感染豬的最常見VP4*基因型為P[6]、P[7][13]。P[6]基因型輪狀病毒毒株首次在美國患腹瀉乳豬的腸內容物中被發現，隨后發現P[6]基因型逐漸成為豬輪狀病毒的最主要流行株[14]。而P[6]基因型人輪狀病毒最初發現于無癥狀感染的新生兒[15]，隨后很快成為人類輪狀病毒感染的一個主要流行基因型[16]。目前研究發現大量人豬重配或重組毒株與P[6]基因型輪狀病毒相關。

HBGAs是通過糖基轉移酶識別其前體糖鏈并漸漸添加單糖而合成的糖復合物[17]。不同血型的個體可以感染不同P型RV，人類HBGAs的遺傳多樣性及RV基因型的多樣性可能導致RV易感性的差異。而RV流行的最主要基因型P[4]、P[6]和P[8]與HBGAs結合的結構和功能基礎還不清楚[11]。本研究選取的是人P[6]基因型輪狀病毒LL4260毒株，通過對其VP8*基因克隆和蛋白表達得到VP8*核心區的蛋白。

本研究選擇載體pET30a，僅在下游引物中加入終止密碼子和6個組氨酸(his標簽)，利用his標簽進行蛋白純化，所表達純化的蛋白僅在C端多了6個組氨酸，避免因氨基酸引入干擾蛋白功能和結晶。可溶于上清的表達蛋白通過與純化柱結合，先用低濃度的咪唑溶液去除雜蛋白，再用高濃度的咪唑洗脫液洗下目的蛋白。本研究選擇P[6]基因型輪狀病毒LL4260毒株VP8*核心區進行pET30 a-LL4260VP8*core蛋白的表達，利用分子篩層析進行蛋白純化，SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白純度較好，相對分子質量為22×103。可直接用于受體結合等功能研究及蛋白結晶結構研究。

綜上，本研究構建了P[6]基因型輪狀病毒LL4260毒株VP8*核心區的pET30 a-LL4260VP8*core重組質粒，表達純化得到相應核心區目的蛋白，為進一步的功能學研究和晶體結構學研究打下基礎，也將為RV新型疫苗和藥物研制及預防控制手段和策略的實施提供參考。

利益沖突:無

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