EV71中和表位嵌合病毒樣顆粒的表達純化

梁璞 伊瑤 蘇秋冬 畢勝利

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

作為一種天然納米顆粒，病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)可以將外源表位高度重復的展示在其表面，易被抗原提呈細胞識別以提高B細胞、輔助性T細胞及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)產生免疫應答的能力[1],已經廣泛用于疫苗研究領域[2-4]，其中目前效果最好、應用最多的就是乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)。HBcAg是由180或240個相同多肽亞單位組成的二十面體顆粒，其表面的α-螺旋組織結構允許補源多肽序列插入到主要免疫顯性區域羧基端以及氨基端等多個位點，并保持甚至增強其免疫原性[5]。正確折疊和自我組裝成VLPs[2]，且對人體無細胞毒性，是制備病毒亞單位疫苗的理想載體[7]。

腸道病毒71型(EV71)是引起手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體，手足口病好發于5歲以下兒童，傳染性極強，近十年里，手足口病的年發病率一直位居我國法定傳染病報告榜首[8]。EV71是一種嗜神經性病毒，其導致的手足口病更傾向于引發嚴重的中樞神經系統、呼吸系統和心血管系統并發癥[9-10]。EV71是屬于小RNA病毒科人腸道病毒A組(EV-A)的，單股正鏈RNA病毒，編碼VP1～VP44種結構蛋白和7種非結構蛋白[10-11]，VP1～VP3位于病毒衣殼表面，目前已證實VP1上的SP70與SP55線性表位可以有效刺激中和抗體產生，尤其是SP70表位氨基酸序列在EV71的所有基因亞型中均高度保守[12]，且免疫原性明顯強于SP55[13]。但單純的多肽片段免疫原性相對較差，需要強佐劑或是一種理想的抗原表位展示系統來增強SP70對B細胞的刺激作用。

故本研究將EV71中和表位SP70插入截短HBcAg的主要免疫顯性區域，利用原核表達系統，得到純化的表面重復展示SP70表位的嵌合HBc-SP70 VLPs，用以增強SP70的免疫原性，該基因重組VLPs可以作為備選的EV71亞單位疫苗，為下一步開展動物實驗評價其免疫保護效果提供基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑E.coliBL21(DE3) 感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶NedI、XhoI以及T4連接酶購自日本TaKaRa公司；Anti-HBc單克隆抗體購自美國abcam公司；Anti-sp70單克隆抗體購自北京京天成生物技術有限公司；HRP Goat Anti-Mouse IgG購自美國ABclonal公司；BCA Protein Assay Kit 購自美國Thermo Scientific公司。

1.2制備HBcAg嵌合SP70病毒樣顆粒

1.2.1 基因合成：將位于EV71中和表位SP70(YPTFGEHKQEKDLEY)插入HBcAg截短氨基酸序列(AA1-144)中的第78與79位氨基酸殘基之間(圖1)，按照大腸埃希菌偏好對該重組蛋白HBc-SP70基因片段進行密碼子優化，并在SP70編碼基因兩端分別加酶切位點BamHI和SnaBI，在重組蛋白基因片段5′端引入酶切位點NdeI，3′端加終止密碼子后連接酶切位點XhoI。之后交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因合成。

圖1 HBc-SP70表達質粒示意圖Fig.1 Schematic diagram of HBc-SP70 expression plasmid

1.2.2 構建目的蛋白表達質粒：重組蛋白基因片段人工合成后用限制性內切酶NdeI和XhoI酶切后與經相同酶切處理的表達載體pET-43.1 a連接，連接產物轉化入E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，37 ℃培養過夜。次日挑取單克隆菌落進行培養及質粒提取，并通過NdeI和XhoI雙酶切篩選陽性克隆質粒，將測序鑒定正確的重組質粒保存備用，命名為pHBc-SP70。

1.2.3 目的蛋白HBc-SP70的表達和純化：將轉化入pHBc-SP70的E.coliBL21(DE3)接種于含氨芐青霉素(50 μg/ml)的LB培養基(10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl)中，30 ℃震蕩培養過夜后加入等量新鮮LB培養基，37 ℃繼續震蕩培養至OD600值達到0.6左右時加入IPTG終濃度達到1 mmol/L，32 ℃繼續震蕩培養4 h。之后離心(4 000 g，10 min，4 ℃)收集菌體，用 mmol/L 10 Tris-HCl緩沖液(含0.01% Triton X-100，pH8.0)重懸菌體后冰上超聲破碎(200 W，作用10 s，間隔30 s，15個循環)，離心(13 800 g，5 min)取上清液加入DEAE陰離子交換柱，收集未結合介質的穿柱液，上樣完畢后用100、200、400 mmol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，并收集相應洗脫液。通過SDS-PAGE觀察目的蛋白在穿柱液及各梯度洗脫液中的分布情況。取目的蛋白所在液體組分以10%CsCl溶液墊層后離心(99 9000 g，5 h)，沉淀用PBS緩沖液重懸后進一步做0%～60%CsCl密度梯度離心(87 000 g，16 h)，注射器抽取離心管中目的蛋白層，經SDS-PAGE確認后即為純化的目的蛋白HBc-SP70，用PBS 溶液在4 ℃透析過夜，于0 ℃保存。

1.3鑒定目的蛋白HBc-SP70的形態、濃度及抗原性

1.3.1 HBc-SP70的電鏡觀察：取適量目的蛋白鋪展于載網上，磷鎢酸染色處理，透射電鏡觀察。

1.3.2 HBc-SP70的濃度檢測：根據BCA Protein Assay Kit操作說明制備牛血清白蛋白(BSA)標準品和BCA工作液，之后采用微孔板方案進行實驗，檢測各孔在562 nm處的吸光值，并結合標準品濃度(μg/ml)繪制標準曲線，計算待測蛋白濃度。

1.3.3 Western blot鑒定：純化的HBc-SP70 VLPs上樣15% SDS-PAGE后半干轉至硝酸纖維素膜(NC)，經含5% 脫脂牛奶的TBST封閉過夜后，用anti-SP70單克隆抗體或anti-HBc單克隆抗體室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后室溫孵育HRP標記的羊抗鼠IgG抗體1 h，洗膜后顯色。

1.3.4 ELISA鑒定：200 ng/孔HBc-SP70 VLPs包被96孔酶標板4℃過夜，次日用含5%脫脂奶的PBST 37℃封閉2 h，加入anti-SP70單克隆抗體或anti-HBc單克隆抗體100 μl/孔37℃作用1 h，洗板后加入HRP標記的羊抗鼠IgG抗體37℃孵育30 min，洗板后顯色15 min，酶標儀檢測各孔450 nm處吸光值。

2 結果

2.1嵌合HBc-SP70VLPs的構建表達和純化如圖1構建的重組質粒pHBc-SP70經NdeI和XhoI雙酶切鑒定，證實重組蛋白HBc-SP70基因片段(507 bp)表達載體pET-43.1 a，測序確認無突變、移碼等現象。

SDS-PAGE分析可見，轉化入E.coliBL21(DE3) 的pHBc-SP70經誘導后，在約18.3×103處有明顯目的蛋白表達條帶(圖2 A，泳道1)，表明重組質粒pHBc-SP70在大腸埃希菌中可有效表達，之后經超聲破碎菌、離心后，目的蛋白主要存在于上清中(圖2 A，泳道2), 而且因為不能與DEAE層析介質結合，目的蛋白主要存在于穿柱液中，且約占穿柱液中總蛋白量的60%～70%(圖2 A，泳道3)。穿柱液經10%CsCl溶液墊層離心后，沉淀被重懸并進行過夜CsCl密度梯度離心，最后在10%～20%CsCl密度區間內可見一條明顯的白色濃縮蛋白層(圖2B)，經SDS-PAGE確定為目的蛋白HBc-SP70，且純度在90%以上(圖2C)。

A：1，pHBc-SP70經誘導大量表達后的全菌蛋白；2，超聲溶菌后的離心上清液；3，DEAE離子交換層析后的穿柱液；4～6，100、200、400 mmol/L NaCl洗脫液.C：1，純化的目的蛋白圖2 目的蛋白的表達純化(A)，CsCl密度梯度離心后目的蛋白在離心管中的位置(B)SDS-PAGE鑒定圖B離心管中的純化目的蛋白(C)A: 1, The distribution of the total bacterial protein after large-scale expression; 2, The supernatant after sonication; 3, Flow through during the DEAE chromatography; 4～6, elutes washed by 100, 200, 400 mmol/L NaCl. C: 1, Purified target proteinFig.2 The expression and purification of HBc-SP70 VLPs (A), The position of HBc-SP70 VLPs in the centrifuge tube after density gradient centrifugation (B). SDS-PAGE analysis of the purified target protein in the centrifuge tube (C)

2.2嵌合HBc-SP70VLPs的鑒定在透射電鏡下，可看到大量純化融合蛋白HBc-SP70自發折疊組裝為直徑約28 nm的二十面體空心病毒樣顆粒(圖3 A)。純化后總蛋白濃度為1.11 mg/ml。

Western blot結果顯示，無論采用抗HBc或抗SP70單抗作一抗，NC膜上約18.3×103處都有一條明顯雜交帶存在(圖3B和3C)；ELISA結果也顯示，檢測抗體為抗HBc或抗SP70單抗時，包被目的蛋白的實驗孔在450 nm處的吸光值與空白對照孔(NC)比較均顯著增高，差異具有統計學意義(P<0.001)(圖3D)。WB與ELISA結果均證實嵌合HBc-SP70 VLPs具有良好抗原性。

1：HBc-SP70 VLPs；2：陰性對照；NC：陰性對照；***：P< 0.001圖3 嵌合HBc-SP70 VLPs的電鏡照片(A).目的蛋白的Western blot鑒定結果：一抗為抗HBc單克隆抗體(B)，一抗為抗SP70單克隆抗體(C).目的蛋白作包被抗原，ELISA間接法鑒定結果1: HBc-SP70 VLPs; 2: negative control; NC: negative control; ***: P< 0.001.Fig.3 Electron microscopy image of the chimeric HBc-SP70 VLPs (A). Detection of purified HBc-SP70 by Western blot assay with anti-HBc monoclonal antibody (B), or with anti-SP70 monoclonal antibody (C). Detection of purified HBc-SP70 by indirect ELISA (D)

3 討論

目前雖然商品化的EV-A71滅活疫苗已投入使用，但EV71衣殼蛋白VP1與人類腦組織蛋白之間存在共同抗原表位，可誘導機體產生高濃度的自身反應性抗體[14]，所以全病毒疫苗具有引起自身免疫性攻擊的潛在可能，研發新的基因重組亞單位疫苗十分必要。本研究以HBcAg截短序列為嵌合VLPs骨架，一方面避免了結合感染性核酸的可能，因此在電鏡下可以清晰看到HBc-SP70VLP3為空心顆粒(圖3 A)；另一方面有研究發現[15]，全長的HBcAg優先激發Th1 型免疫反應，主要與細胞免疫與局部炎癥反應有關，而截短HBcAg則優先激發Th2型免疫反應，主要參與體液免疫應答，涉及B細胞增殖分化與抗體的產生，因此本研究利用截短HBcAg制備的嵌合VLPs可以促使其表面展示的中和表位更有效刺激機體內體液免疫系統，產生更高效價的中和抗體預防EV71感染。另外本研究對嵌合HBc-SP70 VLPs的純化方法也做了優化：前人研究中[13]，重組質粒經IPTG誘導后37℃表達2 h，導致超聲破菌后，目的蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，之后再經過洗滌復性等操作，不但降低了目的蛋白表達量，而且容易造成VLP3表面抗原表位丟失，所以本研究采用32℃低溫誘導表達4 h，既提高了目的蛋白表達量，也使HBc-SP70融合蛋白一直以可溶狀態存在，避免了變性復性對目的蛋白免疫原性的影響；再者本研究構建的融合蛋白羧基端沒有連接His標簽，更利于VLPs的自發折疊組裝[16]，還可以避免刺激機體產生抗His標簽抗體，而大多數抗His標簽抗體均可與血紅素及多種正常組織結合[17]，不利于后期免疫效果評價。綜上所述，本研究構建的嵌合HBc-SP70 VLPs不僅可以作為未來備選的EV71基因重組亞單位疫苗，對HBcAgVLP3的表達純化方法還可以廣泛應用于制備其他疫苗、抗腫瘤藥物或者檢測試劑等。

利益沖突:無

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