不同濃度乙型肝炎病毒全基因組高通量測序方法的建立及其應用

王賢軍 劉云惠 孟飛 楊寧敏

310006 杭州市第一人民醫院檢驗科(王賢軍)；310030 杭州致遠醫學檢驗所有限公司(劉云惠、孟飛、楊寧敏)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一種逆轉錄DNA病毒，發現變異株混合體是HBV免疫預防的關鍵[1-2]。目前，傳統Sanger測序只能檢測到宿主體內特定病毒株序列片段，對基因全長及大量的低頻突變檢測存在局限性，不能真實反映病毒在宿主體內的情況[3]。高通量測序可以在一次測序中對數十萬到數百萬條的HBV序列進行深度測序[4-5]，可檢測出病毒低頻率突變。但由于血液中宿主核酸量大，干擾因素多，高通量測序前的文庫構建成為HBV等病毒全基因組測序亟待解決的問題。尤其是針對低濃度的血液樣品，需要探索建立一種切實可行的建庫方式。本研究分別采用病毒核酸直接建庫及病毒擴增子建庫的方法，對高、中、低拷貝的HBV病毒血液進行高通量測序，從覆蓋度、深度及宿主內單核苷酸變異分析(intra-host single nucleotide variations，iSNVs)對HBV基因組進行分析。

1 材料與方法

1.1病例選擇入選2016年3～12月杭州市第一人民醫院住院部收治的HBV感染患者18例為研究對象。本研究經杭州市第一人民醫院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2病毒基因組提取將18份血液分別分離血漿大于500 μl，使用干凈的EP管分裝后，4 ℃，10 000 xg離心15 min，收集上清200 μl。按照PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit(美國，Thermo Fisher Scientific公司)要求提取HBV DNA。最后，用25 μl RNAase-free水洗脫DNA后置于-20 ℃保存。

1.3病毒濃度測定及高通量測序樣本選擇采用乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)(中國，深圳市普瑞康生物技術有限公司)，以提取的病毒核酸為模板，對HBV病毒DNA樣本進行定量(拷貝/ml)。所有操作均按照試劑盒說明進行。根據HBV DNA定量的結果，選擇3個不同拷貝數樣品作為高通量測序對象：A.低拷貝數(2.67×103拷貝/ml)樣品；B.中等拷貝數(4.95×105拷貝/ml)樣品；C.高拷貝數(1.83×107拷貝/ml)樣品。

1.4巢式PCR擴增引物設計及HBV基因組擴增由生工生物工程(上海)股份有限公司合成巢式PCR擴增引物，以3個不同濃度HBV核酸為模板，以AR1(Forward)5′-ACAGTGGGGGAAAGC-3′，P3(Reverse)5′-CTCGCTCGCCCAAATTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3′為第一段第一輪擴增引物；以AF1(Forward)5′-GTCTGCGGCGTTTTATC-3′，P4(Revers-e)5′-CTGGTTCGGCCCAAAAAGTTG CATGGTGCTGG3′為第二段第一輪擴增引物進行PCR擴增。待第一輪PCR擴增結束后，分別以第一輪PCR產物為模板，以AR2(Forward)5′-AGA AACGGRCTGAGGC-3′，P3(Reverse)5′-CTCGCTCGCCCAAATTTTTCACCTCTGCCTAAT CA-3′為第一段第二輪擴增引物；以AF2(Forward)5′-TGCCCGTTTGTCCTCTA-3′，P4(Reverse)5′-CTGGTTCGGCCCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3′為第二段第二輪擴增引物進行第二輪PCR擴增。巢式PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，35(第一輪)/20(第二輪)個循環；72 ℃延伸5 min。反應均使用LA Taq聚合酶(5U/μl)PCR套裝(日本，TaKaRa公司)。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行Sanger測序，驗證2段HBV基因片段正確性。

1.5文庫的制備和高通量測序病毒核酸直接建庫組：A、B、C三個不同濃度的核酸經Qubit2.0定量后，直接按照Nextera XT DNA Library Preparation Kit試劑盒(美國，Illumina公司)說明進行文庫構建。

病毒擴增子建庫組：巢式PCR擴增分別進行兩段第一輪PCR擴增，擴增產物分別使用磁珠純化，再進行第二輪PCR擴增后，磁珠純化且用Qubit2.0測定濃度，等摩爾混合，再次使用Qubit2.0定量，作為擴增子測序建庫DNA樣本。按照Nextera XT DNA Library Preparation Kit試劑盒(美國，Illumina公司)操作進行文庫構建。兩組文庫構建完后，再次用Qubit2.0測定濃度，使用Aligent2000(美國，Agilent Technologies公司)檢測待測序文庫的質量。對混合樣本使用Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序。

注：X軸表示HBV基因組中的核苷酸位置，Y軸表示讀取的位點深度圖1 HBV參考基因組上的數據的覆蓋和位點深度Note: X-axis represents nucleotide position in the HBV genome; Y-axis represents the site-depth of reads.Fig.1 The coverage and site-depth of reads on HBV reference genome

1.6數據分析對FASTQ格式的原始數據進行過濾處理。為了降低突變的錯誤率，過濾掉起始的10個堿基，并截斷了每個> Q20讀數的末端30個堿基。使用Bowtie2軟件將其余的正確配對的數據與HBV B型參考基因組(GenBank序列號AB981583)進行匹配。使用映射算法中的默認參數調用iSNVs。

2 結果

2.1巢式PCR擴增結果經過兩輪PCR后，第一段和第二段的產物分別為2 092 bp和1 320 bp。Sanger測序的結果表明，PCR產物的序列屬于HBV全基因組。由此可見，不同濃度的HBV樣品可以采用本研究中使用的巢式PCR擴增HBV全基因組。

2.2病毒核酸直接建庫對高通量測序的影響病毒核酸直接建庫組，經過高通量測序后，獲得原始數據。過濾掉低質量數據后，獲得平均177萬的數據用于下一步的生物信息學分析，其中樣品A有1.6 M數據，樣品B有1.7 M數據，樣品C有2.0 M數據。將數據中人類基因組數據剔除，剩余數據匹配到病毒數據庫。結果顯示，匹配到HBV基因組的數據量很低，在高拷貝數樣品C和中間拷貝數樣品B中僅分別匹配10個數據和4個數據，而低拷貝數樣品A沒有數據匹配到HBV基因組。這表明，病毒核酸直接建庫不能應用到高通量測序中，尤其是病毒含量低的樣本，因人類基因組數據干擾過大，使得測序后有效數據量極少。

2.3巢式PCR擴增子建庫對高通量測序的影響巢式PCR擴增子建庫組，將高通量測序的原始數據經過過濾低質量數據處理后，獲得每個樣品平均6 034個待分析數據，范圍從5 395至6 806。處理后的雙末端讀數與HBV基因組的參考序列比對，3個樣品匹配率都接近80%。而且每個樣品都具有相近的量級，說明本次高通量測序覆蓋程度和深度良好，見表1。根據3個樣品的測序覆蓋度和深度圖可以看出：HBV基因在nt1 823～nt1 841位置的測序深度不足，這是由于HBV基因組結構在此位置存在缺口；測序結果在nt500～nt750的位置也具有較低的深度，這是因為該片段DNA在相鄰擴增子之間序列重疊造成，見圖1。這種兩組較低測序深度是不可避免的。因此，不同拷貝數的樣品通過巢式PCR擴增子建庫，經過高通量測序，能夠獲得均勻性數據且數據偏差低。

表1 擴增子高通量測序結果

Tab.1The results of amplicon-sequencing

2.4巢式PCR擴增子建庫測序iSNVs分析基于與Bowtie2比對的結果，用SAMTOOLS 軟件對iSNVs進行比對。由表2可知，3個樣品均識別出了iSNVs，平均突變深度為64。對27個iSNVs進行了深入研究，突變頻率最低為0.02，最高為0.8。在特殊情況下，參考堿基突變為低頻率的兩個不同堿基。結果發現27個iSNVs中有15個發生在逆轉錄(reverse transcription， RT)區域，有13個突變頻率≤20%的iSNVs，表明低頻突變在大多數HBV患者中廣泛流行。RT區的突變出現在所有低拷貝數和中等拷貝數樣品中，而在高拷貝數樣品中幾乎沒有突變。

3 討論

HBV是已知感染人類最小的DNA病毒，基因組僅有3.2 kb左右。HBV基因組是部分雙鏈結構，存在有2處缺口[6]，導致了HBV全長基因組擴增困難。1995年Gunther等[7]設計出避免延伸跨越缺口區的引物，解決了一步法擴增出HBV基因全長的問題，但對低拷貝的樣本靈敏度不高。為了解決靈敏度不高的問題，陸續有研究[8-10]提出采用巢式PCR法擴增HBV基因組，并成功擴增了低拷貝數HBV基因組樣本。前期，本研究嘗試采用一步法擴增低拷貝HBV樣本基因組，結果7個低拷貝樣本中有6個擴增失敗。此次采用兩步巢式PCR成功擴增了高、中、低拷貝數的HBV基因組全長，并比較了擴增子建庫和病毒核酸直接建庫對高通量測序結果的影響。

表2 3個樣品中檢測到的iSNVs情況

結果發現，相比病毒核酸直接建庫測序，擴增子建庫測序在數據量需求方面具有巨大的優勢。在本研究中，病毒核酸直接建庫測序剔除了176萬個有效讀段數據，只有幾個讀數可以匹配到HBV基因組。然而，擴增子建庫測序可以匹配到HBV的整個基因組。病毒核酸直接建庫測序可用數據量低，推測可能是樣本在HBV核酸提取過程中人類基因組污染造成，或者是樣本出現了溶血現象。在本研究中，盡管3個血漿樣本中HBV基因組的拷貝數差異很大，但巢式PCR測序產生的讀數幾乎沒有差異。此外，巢式PCR擴增建庫增加了HBV的拷貝數從而增加了測序的有效讀數量。對于低拷貝數樣本，尤其是低質量病毒樣本，高通量測序時應優先選擇巢式PCR與高通量測序相結合的測序方法。這種方法不僅能夠獲得較好的數量產量，還能夠檢測到傳統測序或直接測序無法獲得的低頻堿基突變情況。

長期使用核苷(酸)類似物治療進行抗病毒治療會導致病毒基因組變異。基因組變異對抗病毒治療的效果的影響尚不清楚，但已有報道指出病毒基因組變異可加速疾病的發展進程[11]。本研究中，雖然未發現已知與核苷(酸)類似物治療相關的突變位點，但3個樣本中發現的27個iSNVs中的15個RT編碼區，提示使用核苷(酸)類似物治療HBV感染時要重視RT區域的突變。本研究發現HBV基因組RT區的所有突變均出現在低拷貝數和中等拷貝數樣品中，而在高拷貝數樣品中幾乎未發現。前期也有研究報道，HBV含量低的樣本(<105拷貝/ml)中核心蛋白(HBc)突變頻率高于HBV含量高的樣本(> 105拷貝/ml)[12]。HIV-1感染的研究中也發現類似的現象，HIV-1病毒含量低(<103拷貝/ml)的樣本中基因組含有較多的抗性突變[13]。本研究表明HBV基因組的突變更容易發生在低拷貝樣本，RT區域的基因突變可能在HBV感染和治療中起著重要作用。

綜上所述，本研究建立了一種方便、經濟有效的方法來揭示不同濃度HBV基因組和突變的完整情況，為研究HBV突變變異、基因蛋白功能、抗HBV細胞因子、乙型肝炎病患個體化檢測治療等提供了豐富的理論和技術支持。后期的研究應該對低頻突變更加重視，特別是低拷貝數樣本中的低頻突變。

利益沖突：無

參考文獻

[1] Locarnini S, Zoulim F. Molecular genetics of HBV infection[J]. Antivir Ther, 2010, 15 (Suppl 3):3-14. DOI: 10.1080/10584580802096531.

[2] Castelain S, Descamps V, Brochot E, et al. High association of T1858-G1896 precore mutations with impaired base pairing and high hepatitis B virus DNA levels in HBeAg-negative chronically infected patients[J]. Arch Virol, 2017,162(7):1913-1920. DOI: 10.1007/s00705-017-3312-6.

[3] 張書鳳, 華文浩, 何艷群, 等. 乙型肝炎病毒基因型耐藥檢測和臨床因素分析[J]. 國際檢驗醫學雜志, 2016,37(17):2376-2378. DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.007.

[4] Szpara ML, Parsons L, Enquist LW. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations[J]. J Virol, 2010, 84(10):5303-5313.DOI: 10.1128/JVI.00312-10.

[5] Barzon L, Lavezzo E, Costanzi G, et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology[J]. 2013, 58(2):346-350. DOI:10.1016/j.jcv.2013.03.003.

[6] Feitelson M. HBV Genome Structure and Expression[M]. Molecular Components of Hepatitis B Virus. Springer US, 1985:132-143.

[7] Gunther S, Li BC, Miska S, et al. A novel method for efficient amplification of whole hepatitis B virus genomes permits rapid functional analysis and reveals deletion mutants in immunosuppressed patients[J]. J Virol, 1995,69(9):5437-5444.

[8] Taha SE, El-Hady SA, Ahmed TM,et al. Detection of occult HBV infection by nested PCR assay among chronic hepatitis C patients with and without hepatocellular carcinoma [J]. Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 2013, 14(4):353-360.DOI:10. 1016/j.ejmhg. 2013.06.001.

[9] 張天英, 陳清瑞, 楊炳春, 等. 高靈敏度巢式PCR方法擴增HBV全長基因組[J]. 廈門大學學報(自然科學版), 2011,50(5):947-950.

[10] Vincenti D, Solmone M, Garbuglia AR, et al. A sensitive direct sequencing assay based on nested PCR for the detection of HBV polymerase and surface glycoprotein mutations[J]. J Virol Methods, 2009,159(1):53-57.DOI:10.1016/j.jviromet.2009.02.027.

[11] 王慧, 高春芳. 乙型肝炎病毒基因變異與肝癌的相關性研究[J].中華肝臟病雜志, 2013, 21(10):788-792. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2013.10.020.

[12] Sendi H, Mehrab-Mohseni M, Shahraz S, et al. CTL escape mutations of core protein are more frequent in strains of HBeAg negative patients with low levels of HBV DNA[J]. J Clin Virol, 2009,46(3):259-264. DOI: 10.1016/j.jcv.2009.08.002.

[13] Prosperi M C, Mackie N, Di Giambenedetto S, et al. Detection of drug resistance mutations at low plasma HIV-1 RNA load in a European multicentre cohort study[J]. J Antimicrob Chemother, 2011, 66(8):1886-1896. DOI: 10.1093/jac/dkr171.