來源于H5N1患者的VH1-2編碼廣譜抗體的篩選與功能研究

孫穎 白天 李梓 阮菲兒 陳玲玲 魯健 劉麗琦 王大燕 舒躍龍 秦堃

周劍芳

100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 中國國家流感中心

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，除了引發(fā)季節(jié)性流感的H1N1、H3N2和B型流感病毒之外，一些新型禽流感病毒(包括H5N1、H5N6、H6N2、H9N2、H7N9和H10N8等)可由禽感染人類，對人類健康造成了巨大威脅[1-3]，因此，尋找有效的流感治療措施十分重要。

血凝素(Hemagglutinin，HA)是流感病毒表面重要的糖蛋白，近年來，研究者發(fā)現(xiàn)大量可以對不同的流感病毒產(chǎn)生交叉保護作用的抗HA廣譜中和抗體[4-12]可有效應(yīng)對由HA抗原的高度變異所導(dǎo)致的免疫逃逸，對流感的防治具有重大意義。本研究通過對H5N1患者外周血中循環(huán)的B細胞進行體外培養(yǎng)及篩選獲得可表達流感抗體的B細胞，對其抗體基因庫進行擴增篩選，得到了由VH1-2編碼的抗HA廣譜反應(yīng)性抗體基因序列，并對其編碼抗體的功能進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料293T細胞及MDCK細胞為本實驗室保存。飼養(yǎng)細胞為表面表達人CD40 L的3T3細胞，經(jīng)Co60照射，液氮保存。實驗所用毒株A/Shanghai/1/2009(2009pdmH1N1, SH-H1N1), RG A/Hubei/1/2011(H5N1, HB-H5N1), RG A/Guangdong/1/2014(H5N6, GD-H5N6), A/waste water/Guangxi/2/2010(H6N2, GX-H6N2), A/HongKong/2009(H9N2,HK-H9N2), A/environment/Jiangxiboyanglake/1102/2014(H12N5, JX-H12N5), A/Hong Kong/01/1968(H3N2, HK-H3N2), RG A/Anhui/1/2016(H7N9, AH-H7N9) 和RG A/Jiangxi/346/2013(H10N8, JX-H10N8)。質(zhì)粒pVRC-GX/H5N1-HA、pVRC-GX/H5N1-NA、pVRC-GD003/H7N9-HA、 pVRC-AH/H7N9-NA的基因分別來源于A/Guangxi/1/2008(H5N1)、A/Anhui/1/2016(H7N9)、A/Guangdong/17SF003/2016(H7N9)，質(zhì)粒pNL4-3.luc為本室保存。重組HA蛋白HB-H5(A/Hubei/1/2011)和ZJ-H7(A/Zhejiang/1/2013)，由本室使用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達純化。

1.2間接ELISA實驗以HB-H5或ZJ-H7蛋白1 μg/ml，50 μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜；1%BSA封閉1 h后使用PBST洗滌；待檢抗體從80 μg/ml開始做二倍稀釋，50 μl稀釋后的抗體或培養(yǎng)上清原液加入洗滌后的酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h；充分洗滌之后加入1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗人IgG(中杉金橋),37 ℃孵育1 h；充分洗滌，使用100 μl TMB顯色，50 μl 2 mmol/L H2SO4終止后讀取450 nm/630 nm處光吸收值。取空白對照10倍以上為陽性。

1.3假病毒(pps)制備及假病毒中和試驗(ppsNT) 將對應(yīng)的HA、NA表達質(zhì)粒與pNL4-3.luc共轉(zhuǎn)染293T細胞，制備GX-H5N1和GD003-H7N9假病毒。轉(zhuǎn)染后48 h收集轉(zhuǎn)染上清，1 350×g離心10 min去除沉淀，用0.22 μm針頭濾器(Millipore)抽濾后保存于4 ℃?zhèn)溆谩DCK細胞按3×104個/100 μl接種96孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)過夜。待檢抗體從80 μg/ml開始做二倍稀釋，50 μl稀釋后的抗體或培養(yǎng)上清原液與50 μl假病毒混合，37 ℃相互作用1 h。使用PBS洗板1次，將抗體和假病毒混合液感染MDCK細胞,37 ℃，12 h后換含2% FBS MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用報告基因檢測試劑盒(PerkinElmer)檢測相對熒光單位(RLU)。平行設(shè)置假病毒對照和細胞對照。中和百分率(%)=(假病毒對照RLU-檢測血清RLU)/(假病毒對照RLU-細胞對照RLU)×100%。取中和百分率>80%為陽性。

1.4B細胞培養(yǎng)、篩選及基因庫構(gòu)建、篩選本實驗所使用外周血單個核細胞(PBMC)標(biāo)本于2009年分離自一位H5N1患者感染后20 d的外周血，凍存于液氮中。利用人記憶性B細胞分選試劑盒(STEMCELL)從復(fù)蘇的PBMC中分離出CD19+ B細胞，將大約20個B細胞與2×104個飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)在96孔板中，加入20 ng/ml hIL-2，1 μg/ml CpG2006和10 ng/ml hIL-21。培養(yǎng)10 d后篩選培養(yǎng)上清對HB-H5和ZJ-H7的結(jié)合。HB-H5結(jié)合陽性孔進一步用GX-H5N1假病毒檢測。然后構(gòu)建抗體輕鏈和重鏈基因庫，方法參照Tiller等研究者[13]，每孔對10個以上重鏈或輕鏈克隆進行測序，通過IMGT網(wǎng)站比對。將同孔的輕鏈、重鏈質(zhì)粒組合，轉(zhuǎn)染293T細胞；培養(yǎng)48 h后，測定上清對HB-H5和ZJ-H7的結(jié)合活性，及GX-H5N1假病毒中和活性。

1.5抗體體外表達及純化將6×106個293T細胞接種于T75中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)過夜；取輕、重鏈質(zhì)粒各10 μg共轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)5 d，期間補加含 10% 低IgG FBS的DMEM培養(yǎng)基；收集轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)上清，865×g離心10 min，用0.45 μm濾器過濾；利用蠕動泵，濾液以1.5 ml/min的速度流過蛋白G純化柱，捕獲IgG；利用AKTA儀器，用pH為2.7的甘氨酸-鹽酸洗脫液洗脫，收集純化的抗體。抗體經(jīng)濃縮，緩沖液置換，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6抗體功能測定首先測定抗體的結(jié)合活性，假病毒中和活性。然后通過流式熒光細胞分選技術(shù)(FACS)檢測廣譜結(jié)合活性： 即用多種亞型流感病毒分別感染MDCK細胞，感染后12～14 h收集細胞；取106個感染細胞與終濃度為5 μg/ml的抗體混合，37 ℃孵育1 h；PBS清洗后加入1∶250稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗人IgG，37 ℃孵育1 h；PBS清洗后上機檢測，使用BD Diva軟件分析。病毒感染用細胞內(nèi)NP蛋白染色確認。

2 結(jié)果

2.1H5N1患者外周血B細胞篩選結(jié)果分選到5.8×104個B細胞，分2928孔進行培養(yǎng)。用HB-H5 對培養(yǎng)10 d的上清篩選，篩選到38孔(1.3%)H5陽性克隆。進一步篩選后有7孔H5/H7雙陽性細胞，約占0.24%，表明此H5N1感染患者外周血中已存在少量交叉反應(yīng)性B細胞。

2.2篩選獲得由VH1-2基因編碼的中和抗體綜合各個孔上清篩選結(jié)果，共挑選14孔B細胞進行抗體基因文庫的構(gòu)建。初篩結(jié)果顯示3-32G7克隆孔為H5/H7雙陽性，該孔擴增獲得一種重鏈，兩種輕鏈。其基因信息如表1所示。初篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VH1-2重鏈與這兩種輕鏈組合表達的抗體具有相似的抗原識別譜和對H5N1 pps的中和功能(表2)。

表1 3-32G7克隆孔抗體基因信息

注：“-”表示沒有此片段

Note: “-” indicates without this segment

表2 VH1-2編碼抗體功能

注：“+”表示抗體具有中和能力

Note: “+” indicates the Abs with neutralizing activity

2.3體外實驗證明VH1-2編碼抗體可中和H5N1假病毒以輕鏈3-32G7-1與重鏈組合進行體外大量表達并純化獲得單抗Ab3-32G7.1。Ab3-32G7.1對HB-H5和ZJ-H7的最低檢測濃度為1.87 μg/ml和6.20 μg/ml(圖1，以空白對照的10倍為最低檢測線)。相較于陰性對照Ab2-11E5(來源于本課題)，Ab3-32G7.1可有效地阻斷GX-H5N1假病毒對MDCK的感染,最低有效濃度為2.20 μg/ml，但對GD003-H7N9假病毒無中和作用(圖2)。

圖1 抗體Ab3-32G7.1對HB-H5和ZJ-H7的結(jié)合能力Fig.1 Binding capacity of Ab3-32G7.1 to HB-H5 and ZJ-H7

圖2 Ab3-32G7.1對GX-H5N1和GD003-H7N9假病毒的中和試驗Fig.2 Neutralization test of Ab3-32G7.1 against GX-H5N1 and GD003-H7N9 PPS

2.4Ab3-32G7.1具有一定的廣譜結(jié)合活性我們使用流式細胞術(shù)測定Ab3-32G7.1對自然表達在被感染細胞表面的不同亞型HA的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)其可以廣譜結(jié)合來自于Group1的H1，H5，H6以及H9亞型毒株的HA，但無法結(jié)合Group2的HA(圖3)。

圖3 Ab3-32G7.1對不同亞型HA的結(jié)合Fig.3 Binding of Ab3-32G7.1 to group 1HAS

3 討論

體液免疫在抵抗病毒性感染疾病中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)抗流感的廣譜中和抗體常由機體記憶性B細胞或漿母細胞產(chǎn)生，且由某些特定的基因編碼，以VH1-69和VH3-30最為常見，如CR6261，F(xiàn)10，CR9114，27F3，F(xiàn)I6等等[5-9,11]。但同時，也存在由出現(xiàn)頻率較低的VH基因所編碼的高質(zhì)量抗體，如由VH6-1編碼的MEDI8852[10]，這幫助我們更全面的認識抗流感病毒免疫的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。本研究中，我們篩選到由低頻率基因VH1-2所編碼的交叉反應(yīng)性抗體，該抗體可有效結(jié)合多種亞型流感病毒的HA，并具有H5N1中和活性。

由VH1-2編碼的抗體在HIV-1病毒和流感病毒感染中均有報道[12,14]。Whittle, J. R.等研究人員從疫苗接種者體內(nèi)篩選到由VH1-2編碼的廣譜中和抗體：CH65[12]。該抗體靶向HA頭部，可以廣譜結(jié)合H1亞型的不同毒株，其重鏈基因由VH1-2/DH1-1/JH6組成。相較而言，本研究發(fā)現(xiàn)的Ab3-32G7.1由不同的重排方式發(fā)育而來，可結(jié)合H1，H5，H6，H9及H7亞型。在3-32G7這一克隆孔中，同時存在兩種不同的輕鏈，均可與VH1-2編碼的這一重鏈組合產(chǎn)生功能相似的抗體。因此H5N1病毒感染可快速誘導(dǎo)體內(nèi)交叉反應(yīng)性B細胞循環(huán)到外周血，從而發(fā)揮效應(yīng)。

流式結(jié)果表明，Ab3-32G7.1可廣譜結(jié)合多種亞型HA，包括H1，H5，H6和H9。然而，ELISA結(jié)果顯示該抗體也可以結(jié)合H7亞型。考慮兩種實驗結(jié)果的差異，我們推斷可能因為其識別HA的表位不同。在本研究中，流式分析所用的HA構(gòu)象處于HA0狀態(tài)，而ELISA實驗所使用HA固定于酶標(biāo)板底部，由于其結(jié)合板底的方位不同可能呈現(xiàn)出不同的表位。這就有可能造成檢測結(jié)果的差異。本課題后續(xù)研究將探索Ab3-32G7.1所靶向的HA表位，及其在不同亞型毒株之間識別構(gòu)象的差別。Ab3-32G7.1僅對H5亞型病毒具有中和能力可能同其體突變程度相關(guān)，具體機制待研究。

本研究從H5N1感染患者發(fā)病20 d的外周血中分離到交叉反應(yīng)性抗體基因并對其功能進行了初步測定。這有助于我們更加深入的了解流感病毒自然感染狀態(tài)下抗體應(yīng)答的遺傳學(xué)特征，以及抗HA廣譜抗體的特性，為有效防治流感提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突:無

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