加味通幽湯對缺氧條件下食管癌細胞血管生成擬態和增殖的影響

玉玲 *

1.華北理工大學中醫學院，河北 唐山 063210；2.華北理工大學研究生學院，河北 唐山 063210

在世界范圍內，我國的食管癌發病率和死亡率均位居各國之首。我國的食管癌病理類型以鱗癌為主，約占食管癌總數的95%左右。食管鱗癌具有進展迅速、早期轉移等特點，絕大多數患者在發現時已處于中晚期，局部復發和遠處轉移較多，總體預后較差，嚴重危害人們健康[1-3]。1999年，Maniotis 等在對人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中發現了血管生成擬態(vasculogenic mimicry, VM)，血管生成擬態是對傳統腫瘤血管生成理論的補充。腫瘤增生過快造成腫瘤微環境始終處于相對缺氧和代謝紊亂狀態，這是惡性腫瘤的生長特點之一。研究表明缺氧可觸發機體產生一系列應激性保護反應。腫瘤細胞在沒有內皮細胞的參與下，表型出現轉化，通過自身變形和基質重塑直接形成特有的微循環管道，這種管道能夠執行微血管功能，部分彌補了因為血管新生滯后于瘤體生長所造成的氧和營養供給的缺乏，促進腫瘤迅速增長[4-7]。

食管癌在中醫屬于“噎膈”范疇，“金元四大家”之一李東垣所著《蘭室秘藏》記載有“通幽湯”，是治療瘀血內結，濁氣不降之噎膈[8]的代表方，筆者結合中藥藥理研究成果[9-14]，創制加味通幽湯，獲得國家發明專利(ZL201110308544.0)，全方由桃仁、紅花、升麻、檳榔、半枝蓮和白花蛇舌草6味中藥組成。方中活血化瘀藥桃仁、紅花與行氣散結藥升麻、檳榔抑瘤效果顯著；半枝蓮、白花蛇舌草中含有的黃酮類、總多糖、皂苷等具有顯著的抑瘤和促凋亡作用，臨床廣泛應用于包括食管癌在內的多種實體腫瘤。本研究觀察了加味通幽湯對缺氧條件下食管癌Eca109細胞VM形態和細胞增殖的影響。

1 材料

1.1 動物及細胞株 4～6周齡SD雄性大鼠，體重200～400 g，清潔級，購于中國人民解放軍軍事醫學科學院動物實驗中心，合格證號SCXK-(軍)2014-0001。人食管癌 Eca109 細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。

1.2 藥物與試劑 加味通幽湯(桃仁5 g，紅花15 g，升麻10 g，檳榔5 g，半枝蓮15 g，白花蛇舌草15 g)，各單味藥物均購于北京同仁堂唐山連鎖藥店。

新生牛血清(GIBCO公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，1640培養基(CORNING公司)，PBS緩沖液(BI公司)，10%水合氯醛，Matrigel膠，CCK8(Amersco公司)，10×CoCl2(Sigma公司)，Milli-Q水(Milli-pore公司Milli-Q超純水設備生產)。

1.3 儀器與材料 96孔細胞培養板(美國Corning公司); 24孔細胞培養板(美國Corning公司); 細胞培養瓶(美國Corning公司); 移液管(gibcol公司); 離心管(gibcol公司); 3MK型低溫高速離心機(美國Sigma公司); 1100型無菌超凈臺(美國Forma公司); 3366型CO2培養箱(美國Forma公司); TMD-2倒置式顯微鏡(日本Nikon公司); NOVAPATH 450型酶標光度計(美國Bio-Tek公司)。

2 方 法

2.1 方藥制備 加味通幽湯加入30倍體積的水，浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮40 min，收集藥液，入燒杯中濃縮方藥至200 mL，-20℃凍存，用時調至所需濃度。

2.2 大鼠血清制備 4～6周齡SD大鼠40只，將其隨機分為兩組(對照組15只，含藥組25只)，對照組和含藥組分別灌胃0.9%的生理鹽水和加味通幽湯。調整加味通幽湯濃度：以標準成人用量為基礎，按照大鼠體表面積與人體換算系數，計算大鼠所需生藥量(14.2mg/mL)，以Milli-Q水調整藥液濃度。

兩組大鼠灌胃量均為1mL/d，連續灌胃14 d。最后1次灌胃后12h，腹主動脈取血，離心后取上層血清。將提取到的血清56℃恒溫水浴滅活加熱30 min后，在超凈臺中用針式濾器(0.22μm)過濾除菌，放入EP管中，-80℃冷凍保存備用。

2.3 細胞培養及種板(96孔) 以含有10%的FBS和1%的雙抗1640培養基10 mL接種Eca109細胞于100 mm2培養皿中，待其生長至對數期，PBS沖洗后用0.25%胰酶消化，離心反復吹打成單細胞懸液，細胞密度10000個/mL，每孔接種150μL的懸液，培養1 d。

2.4 細胞形態觀察 24孔板每孔加入300μL Matrigel膠(冰上操作)，置于培養箱30min使其凝固，每孔給予1000μL各實驗組單細胞懸液，培養1d。倒置顯微鏡(×200)下觀察拍攝細胞形態。

2.5 CCK8細胞增殖實驗 取出96孔板，棄培養基。實驗分為A組(對照組)、B組(缺氧組)、C組(含藥血清對照組)、D組(含藥血清治療組)。A組： 10%對照大鼠血清、90%1640空白培養基；B組： 10%對照大鼠血清、10%10mmol/L的CoCl2缺氧誘導液和80%1640空白培養基；C組：10%含藥大鼠血清、90%1640空白培養基；D組：10%含藥大鼠血清、10%10mmol/L的CoCl2缺氧誘導液和80%1640空白培養基。每孔分別加入各組所需培養基100μL，每組設3個復孔。培養1d后，每孔加入10μL的CCK8，培養2h，酶標儀450nm處測OD值。

2.6 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行分析，組間差別顯著性檢驗采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 加味通幽湯對細胞血管生成擬態的影響 4組培養24 h后形態發生明顯變化。鏡下觀察，對照組Eca109細胞成團塊狀生長，無明顯規律。缺氧組細胞則相互連接，成單條或多條管狀結構。在給藥后細胞都發生了凋亡。含藥血清對照組細胞分散無規律，而含藥血清治療組細胞聚集成團狀或條索狀沒有出現管狀結構。如圖1所示。

3.2 加味通幽湯對缺氧條件下細胞增殖的影響 本實驗給予加味通幽湯刺激后，各組間Eca109細胞增殖出現明顯差異(如圖2所示)。與對照組相比，Eca109細胞給予CoCl2處理后，細胞活性明顯降低，此差異具有統計學意義(P=0.000)。Eca109細胞給予含藥血清處理后與對照組相比，細胞活性無明顯變化(P=0.867)。然而，CoCl2刺激Eca109細胞后給予含藥血清治療，細胞活性與含藥血清對照組和缺氧組相比，細胞活性均有所下降，此差異均具有統計學意義(P=0.000)。提示加味通幽湯進一步抑制缺氧誘導的Eca109細胞活性。

4 討論

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤，我國是其高發區[15]，約占全球的50%，同時也是死亡率最高的國家[16]。中醫理論認為其重要病機是內傷飲食、情志不遂互為因果[17]。陳無擇在《三因極一病證方論·卷八》中指出：“喜怒不常，憂思過度，恐慮無時，郁而生涎，涎與氣搏，升而不降，逆害氣滯……與五膈同，但此在咽嗌，故名五噎”，說明憂思郁怒導致氣機郁滯，氣滯或津停生痰，或瘀血內生，交阻于食道，妨礙飲食。古今醫家認為惡性腫瘤患者體內血行不暢、瘀血內停，現代臨床也證實了血瘀是腫瘤形成發展的主要病理機制。故治療當以活血祛瘀、行氣散結。本實驗所使用的加味通幽湯由白花蛇舌草、半支蓮、升麻、檳榔、桃仁、紅花組成，其中桃仁、紅花活血祛瘀；半支蓮、白花蛇舌草可解除體內之瘀毒；檳榔下行而破氣滯，升麻升清而降濁陰，一升一降，胃氣乃通。全方緊扣食管癌的病機，以行氣、活血、祛瘀、滋養陰血為主要功效。

惡性腫瘤的存活和生長離不開血液供應，腫瘤細胞可以在缺氧情況下模擬血管內皮細胞形成一種功能上類似于正常血管的通道，形成另一種腫瘤供血系統，這種血供不需要內皮細胞的參與，但其內部含有紅細胞和血漿，并且還可以與常規的內皮血管相溝通，構成血液輸送網絡，即血管生成擬態。血管生成擬態在包括食管癌在內的多種腫瘤發生、發展、浸潤和轉移過程中有重要的作用,并且與腫瘤的惡性程度密切相關。惡性程度高的腫瘤才能形成VM，而低度的惡性腫瘤不能形成，這是因為惡性程度高的腫瘤生長迅速，更容易形成缺氧的微環境；另一方面惡性濃度高的腫瘤分化差，腫瘤細胞的多能性高，遂能夠模擬內皮細胞并具備相應的功能。由于VM的結構特殊，使腫瘤細胞與血流之間的屏障減弱，容易脫落隨血液運輸而轉移，從而增高了癌轉移的幾率。

本實驗VM形態學觀察顯示，對照組Eca109細胞呈團塊狀聚集生長，給藥后的含藥血清對照組使細胞分散并出現凋亡。在給予缺氧誘導后，細胞惡性程度加重，形成了VM管道以獲得足夠的氧氣。含藥血清治療組的細胞雖呈現團塊聚集生長但是未出現VM，并且呈現不同程度的凋亡。說明加味通幽湯對Eca109細胞血管生成擬態的形成起到了顯著的抑制作用。

惡性增殖是腫瘤細胞最主要的特征，不斷增多的腫瘤細胞導致耗氧量增加，造成腫瘤內部缺氧微環境，促進VM形成，增加細胞氧供，從而形成“細胞增殖-缺氧-VM-再增殖”的循環，而未發生VM的區域常伴隨細胞缺氧凋亡。本研究CCK8實驗結果顯示，對照組和含藥血清對照組細胞活性無差異，缺氧組和含藥血清治療組細胞活性明顯低于相應對照組，提示缺氧導致細胞活性降低；另外，含藥血清治療組細胞增殖低于缺氧組，說明缺氧的Eca109細胞對加味通幽湯更敏感，加味通幽湯進一步抑制缺氧組細胞活性，影響其形成VM。

本研究表明加味通幽湯對食管癌的Eca109細胞VM形成有顯著抑制作用，對Eca109細胞有促進凋亡的作用，但臨床應用還需進一步研究。

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