XRCC1、P53、COX-2基因多態性與客家人群食管癌易感性的關系

李濤 賴春鳳 鄭敏莉 楊宇輝 丘波

嘉應學院醫學院 1病理學教研室，2內科教研室，3生理學教研室（廣東梅州 514031）

食管癌是世界上第六大導致癌癥死亡的原因，發病機制復雜，其病因與組織學類型及所發現的人群都有所不同［1］。在美國，每年都有16 940例新發病例和15 690例死亡病例［2］。而中國，2015年食管癌發病人數估計為477 900例，占全部惡性腫瘤發病的11.1%；估計死亡人數為375 000例，占全部惡性腫瘤病死率的13.3%［3］。同時，在世界范圍內，食管癌具有明顯的地域分布特點，存在從土耳其東部開始，經伊拉克、伊朗、中亞，一直延伸到中國北部的一個食管癌高發地帶。食管癌的發生與不同的遺傳和環境因素有著密切的關系，其中基因的多態性研究與食管癌的關系研究為關注的熱點，但結論不一。客家人群是具有獨特遺傳背景的漢族分支，有著相對特殊的遺傳背景和飲食習慣，而梅州地區是主要的客家人群的聚居地，居民大部分為純正的客家人。有資料顯示，食管癌在1997-2011年均列住院患者惡性腫瘤的第1位［4］，是影響該地區居民的健康水平主要疾病之一。目前，對客家人群食管癌的研究較少，而該人群食管癌與基因多態性的研究國內尚未見報道。因此，本研究通擬過選取DNA損傷修復基因XRCC1 rs25487、細胞增殖、凋亡相關基因P53 rs1042522、COX-2 rs689466位點，檢測其基因型和等位基因在客家人群中的分布特征，探討基因多態性與該人群人群食管癌遺傳易感性的關系，為客家人群食管癌的防治提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 嚴格遵循隨機、均衡及盲法原則，病例診斷嚴格按照ICD-151標準分類，選取了2013年9月至2015年1月在嘉應學院醫學院附屬醫院及廣東省梅州市人民醫院經胃鏡和病理檢查確診的新發住院的食管癌患者122例，并隨機抽取同期健康體檢人群，同為客家人群、同居住年限的非消化道疾病、非腫瘤患者123例作為對照，均做到了知情同意。所有研究對象于住院次日或體檢日清晨抽取外周血3 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-80℃冰箱低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 提取經EDTA-Na2抗凝管采集的靜脈血，用DNA提取試劑盒（Wizard Genomic DNA purification Kit（Promega））提取DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度、純度和降解程度，通過紫外分光光度計檢測OD值，調整DNA終濃度在10～30 ng/μL之間，提取后的DNA保存于-80℃備用。

1.2.2 位點選擇和引物設計 選取XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466位點，根據基因的目標序列和所選擇的多態性位點，運用Sequenom公司的Assay Design 3.1軟件進行引物設計。將合成的引物通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF）進行質檢，檢測實際分子量與理論分子量一致，引物純度均達到實驗要求。引物設計結果見表1。

表1 基因位點及引物序列Tab.1 Gene locus and primer sequences

1.2.3 基因分析 提取純化后的基因組DNA樣品定量稀釋，按設計順序加樣于384孔板上，然后添加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下：1 U的Taq聚合酶，20～ 50 ng基因組DNA，各2.5 pmol的PCR引物，2.5 mmol的dNTP。PCR反應條件為：預變性95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，45個循環，72℃5 min，25℃∞。添加0.3 U的堿性磷酸酶去除剩余的dNTP。單堿基延伸反應通過配制總體積為2 μL的單堿基延伸反應Mix，反應條件為94℃5 s，然后52℃5 s，40個外部循環，80℃5 s×5個內部循環，72℃ 3 min，25℃∞。反應產物用樹脂純化，然后將純化后的延伸產物點樣于384孔SpectroCHIP（Sequenom）芯片上。再經MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解析電離飛行時間質譜）分析，最后運用Typer 4.0軟件檢測質譜峰，并根據質譜峰圖判讀各樣本目標位點基因型。

1.3 統計學方法 分別統計食管組和對照組基因型分布頻率，經Hardy-Wein-berg平衡檢驗后，使用SPSS 18.0統計軟件分析，各基因型及等位基因分布頻率差異用二元Logistic回歸分析以及χ2檢驗，以OR與95%CI表示相對危險度，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組年齡、性別比較 食管癌組（男85例，女37例）與正常對照組（男74例，女49例）之間的性別差異無統計學意義。食管癌組年齡為43～85歲，均數為（59.97±9.09）歲，正常對照組年齡為39～85歲，均數為（57.89± 10.55）歲，經過t檢驗，兩組總體均數的差異也無統計學意義。食管癌組年齡分布具有以下特點：50～60歲食管癌患者比例最大，在55歲左右形成發病高峰，之后隨著年齡的下降而下降。性別上男性多于女性，比值接近2∶1（男∶女）。見表2、3。

表2 兩組之間年齡的比較Tab.2 Comparison of age between the two groups±s

表2 兩組之間年齡的比較Tab.2 Comparison of age between the two groups±s

組別食管癌組正常對照組例數122 123年齡（歲）59.97±9.09 57.89±10.55 t值1.653 P值0.100

例表3 兩組之間性別的比較Tab.3 Comparison of gender between the two groups

2.2 rs25487、rs1042522和rs689466位點多態性分布 對梅州地區客家人群中XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466共3個位點的進行檢測，兩組間基因型分布頻率及等位基因構成比統計結果見表4、5。

表4結果顯示，XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466共3個位點均存在有多態性變化，rs25487基因型GG、GA和AA在食管癌中的分布頻率為：57.38%、37.70%和4.92%，在對照組的分布頻率為47.97%、42.28%和9.75%，組間差異無顯著性（χ2=3.301，P=0.192）；rs1042522基因型CC、CG和GG在食管癌組的分布頻率為：20.49%、54.92%和24.59%，在對照組的分布頻率為17.07%、47.16%和35.77%，組間差異無顯著性（χ2=3.640，P=0.162）；rs689466基因型AA、AG和GG在食管癌組的分布頻率為：22.13%、54.92%和22.95%，在對照組的分布頻率為25.20%、52.85%和21.95%，組間差異無統計學意義（χ2=0.320，P=0.852），再經二元Logistic回歸分析也顯示兩組間各基因型比較無統計學意義。

表4 客家人群基因型在兩組中的分布Tab.4 Distribution of genotypes of Hakkaness in two groups例（%）

表5 客家人群等位基因在兩組中的分布Tab.5 Distribution of alleles of Hakkaness in two groups

表5的結果顯示，XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466各等位基因在兩組間比較差異無顯著性：rs25487（χ2=3.129，P=0.077）、rs1042522（χ2=2.646，P=0.104）、rs689466（χ2=0.203，P=0.652）。

2.3 rs25487、rs1042522和rs689466位點基因型組間年齡、性別分層分析 通過對XRCC1、P53和COX-2基因共3個位點的基因型在食管癌組和正常對照組的年齡和性別進行分層，結果顯示，性別及年齡在兩組間差異均未見有統計學意義（P＞0.05）。提示：XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466位點基因型與不同的年齡、性別與否無關。

3 討論

X線修復交叉互補基因1（X-ray repair crosscomplementing 1，XRCC1），是第一個被分離的哺乳動物基因，在DNA的損傷修復、遺傳不穩定性和腫瘤發生起到關鍵作用。XRCC1參與了離子輻射和化學誘變劑所致DNA損傷后的單鏈斷裂修復（SSBR）和堿基切除修復（BER）。XRCC1 399Arg→Gln的變異降低了個體DNA損傷修復能力，導致體細胞突變及染色體畸變率增加，可能增加腫瘤的易感性。已有多項針對XRCC1基因多態性與惡性腫瘤相關研究［5-7］，其與食管癌關系的研究也有多項報道，但結果不盡一致。YUN等［8］研究發現XRCC1基因與患食管癌的風險無相關，但單體型CGC與減小ESCC的風險有顯著意義（OR：0.62，95%CI：0.40～0.96），認為在中國人群中基因-基因相互作用在食管癌的發展中起了重要作用，LI等［9］研究也顯示在韓國和中國哈爾濱的漢族的人群中XRCC1 Arg399Gln多態性與食管癌無關，與本課題研究結論一致。但是也有部分的研究報道了XRCC1基因Arg399Gln位點位點與食管癌的易感性有一定的關聯性，認為在中國人群中XRCC1 Arg399Gln可以作為一種潛在的食管癌易感性的標志物，尤其是鱗狀細胞癌［10］。

p53抑癌基因，定位于人類染色體17p13.1，有11個外顯子和10個內含子，是腫瘤最常見突變的基因，p53基因編碼區第4外顯子第72位密碼子存在單核苷酸多態性（p53 Arg72Pro，rs1042522），是與腫瘤關系最為密切的一個多態位點，使p53蛋白中的第72位氨基酸由脯氨酸變為精氨酸，引起p53蛋白結構改變和功能異常。迄今為止，已有諸多關于p53 Arg72Pro與食管鱗癌關聯研究的報道，結果也不盡相同。內蒙古［11］的人群研究結果認為p53密碼子72Arg/Pro基因多態性與食管癌易感性相關，與多項Meta分析［12-13］及部分國外報道是一致的［14-15］，但也有相反的報道［16］。環氧化酶（COX）又稱前列腺素合成酶，是花生四烯酸轉變為前列腺素的關鍵酶。COX-2是誘導型環氧化酶，在抑制凋亡、腫瘤生長、血管形成等腫瘤發生過程中起著重要作用。COX-2基因啟動子區存在有-765G＞C和-1195G＞A單核苷酸多態性，其通過改變COX-2基因的表達調控或基因產物的活性而影響腫瘤易感性。多項研究發現-1195G＞A單核苷酸多態性與多種胃腸道腫瘤易感性有著密切相關性［17-19］，-1195AA基因型能增加患ESCC的風險，且環氧合酶2的遺傳性變型可能影響食管癌的易感性［20］。本研究選取的細胞增殖、凋亡相關的位點rs1042522和rs689466，在客家人群中也存在多態性，但研究結果未發現其與食管癌的相關性，與部分研究一致。

客家人群是具有獨特遺傳背景的漢族分支，有著相對特殊的遺傳背景和飲食習慣。客家人在全世界有約1.2億人口，國內約有5 800多萬，客家人也是廣東省三大民系之一。羅香林認為客家人是“中原最純正的正統漢人的后裔”［21］。客家人與中原漢族最近，又偏向于苗瑤語族群中的畬族，不同于其他南方漢族偏向于侗臺語族群［22］，對該群某些基因多態性的研究也顯示其有別于其他漢族民系［23］。以上都提示了遺傳因素與客家人群有著重要的相關性。目前，針對客家人群基因多態性與惡性腫瘤的研究較少，本次研究選取了XRCC1、P53和COX-2基因共3個位點進行了多態性研究，結果顯示出rs25487、rs1042522和rs689466位點在客家人群中均有多態性變化。而經過對基因型和等位基因的分布頻率進行卡方檢驗和二元Logistic回歸分析未發現其位點的多態性變化與該人群的食管癌易感性存在相關性。同時也對性別和年齡進行分層分析也未發現有顯著性相關。本項目的研究結果與國內外部分學者的研究結果是相符合的，可能也反映了以上基因位點多態性的變化與該地區食管癌的遺傳易感性無關，同時也充分說明了基因多態性的特點，可能在不同種族、遺傳背景下，不同地域之間基因多態性存在差異性。但是也需要考慮樣本量較少的原因，本研究的樣本量可能還不足以完全代表該地區整個食管癌人群基因多態性的變化。因此，下一步計劃要了解整個客家人群食管癌遺傳易感性與基因多態性的關系，需要對多個客家地區進行大樣本量的調查，也需要多個醫療機構和醫學院所的共同參與完成，研究數據將為該人群在食管癌的防控中提供理論依據。

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