微流紡海藻酸鹽基纖維敷料的制備及其性能

張小林， 黃 晨， 靳向煜

(東華大學 紡織學院， 上海 201620)

海藻酸是從天然海藻中提取的一種線性多糖生物高分子聚合物，由β-D-甘露糖醛酸(M單元)和α-L-古羅糖醛酸(G單元)通過1，4-糖苷鍵連接而成的嵌段聚合物[1]。海藻酸因其高生物相容性，無毒性及成凝膠性，被廣泛應用于傷口醫用敷料[2]、藥物釋放[3]及組織工程[4-5]等領域。海藻酸大分子鏈結構中的G單元可與Ca2+交聯形成特殊的蛋盒結構[6]，相交聯的鈣離子可與鈉、鉀離子發生交換[7]形成水溶性的藻酸鹽。海藻酸鈣纖維敷料用于創面治療，可通過離子交換由不溶性海藻酸鈣轉變成水溶性海藻酸鈉，吸收大量液體后呈凝膠狀態，使傷口保持相對安全潤濕的環境[8]，加速傷口愈合。

目前國內研究主要集中于傳統濕法紡絲海藻酸鹽纖維的制備技術[1]及其性能表征[9]，探索不同濕法紡絲工藝對海藻酸鹽纖維力學性能、微觀結構和吸濕性能的影響。國外有報道以海藻酸為原料，通過微流紡或者3D打印技術，制備藥物微膠囊[10]、組織支架[11]或醫用敷料[12]，并對其藥物緩釋性能和病理學進行研究。

純海藻酸鹽纖維敷料力學性能較差，降解過快。如何控制海藻酸鹽纖維的降解速率和力學性能及開發新型藻酸鹽纖維仍在探索中。本文在前期研究[7,13]的基礎上，以海藻酸為原料，加入一些無機材料，通過自制微流紡設備紡制新型海藻酸鹽復合纖維敷料。微流紡技術是一種紡絲技術，可紡制微米級材料，通過控制流體的成型等而用于制備纖維材料的一項技術，且紡制過程中涉及到流體學。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

海藻酸鈉(180947-100G，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司)；羥基磷灰石(C10068615，上海麥克林生化科技有限公司)；二氧化硅(C10055745，上海麥克林生化科技有限公司)；氯化鈣(AR500ML，上海凌峰化學試劑有限公司)，胰蛋白酶(質量分數為0.25%)、細胞培養液(美國Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液PBS(Hyclone-SH30256，國藥集團化學試劑有限公司)；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Thermo Fisher公司)；人成纖維皮膚細胞和角質化細胞(美國模式培養物集存庫)。

1.2 實驗儀器

S-4800型掃描電子顯微鏡(日本日立集團)；XQ-1C型高強高模纖維強伸度儀(上海新纖儀器公司)；D/max-2550VB+/PC型18 kW轉靶X射線衍射儀(日本Rigaku株式會社)；Nicolet 6700型紅外光譜儀、Synergy H1型酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；Prodigy型電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP，美國Leeman公司)；LEICA DMi1型倒置顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.3 海藻酸鹽基纖維敷料制備方法

將海藻酸鈉(SA)高分子原料溶于去離子水(DW)中，配制質量分數為4%的海藻酸鈉溶液3份，標記為A、B、C。往A溶液中加入0.1 mg粒徑為(50±5)nm的二氧化硅納米顆粒(SiO2)，B溶液中加入0.1 mg粒徑為(55±5)nm的羥基磷灰石納米顆粒(HAP)。將已配制海藻酸鈉溶液A、B、C分別作為芯層溶液，皮層溶液均為質量分數為3%的氯化鈣溶液，通過自制微流紡絲設備[13]紡制3種類型海藻酸鹽基纖維敷料，其成分如表1所示。

表1 3種纖維芯-鞘流成分Tab.1 Core-sheath compositions of three kinds of fiber

1.4 測試方法

1.4.1纖維表面形態表征

首先使用目測法對海藻酸鹽纖維敷料的外觀形態進行感官評價，然后采用掃描電子顯微鏡(SEM)對纖維表面形態進一步觀察。

1.4.2纖維化學結構表征

采用紅外光譜儀對海藻酸鹽纖維的紅外官能團進行分析。其測試光譜范圍為4 000～600 cm-1，反射模式，并用衰減全反射光譜法對材料的化學成分進行表征。

1.4.3鈣-鈉元素含量測定

依據JY/T 015—1996《感耦等離子體原子發射光譜方法通則》，采用電感耦合等離子體發射光譜儀測試海藻酸鹽基纖維敷料中鈣-鈉元素含量。

1.4.4體外生物礦化測試

將海藻酸鹽纖維敷料浸漬在模擬體液(SBF)中，30 d后取出纖維，用去離子水沖洗，充分去除纖維表面多余礦物質，并用SEM對纖維表面進行觀察，并采用X射線衍射儀(XRD)對其進行測試分析。

1.4.5生物毒性評價

細胞增殖實驗。取3種類型海藻酸鹽纖維各50 mg分別浸漬在50 mL細胞培養液中，放置在恒溫箱中孵化5 d，將所配制的纖維浸提液取出過濾后備用。

分別將人體皮膚成纖細胞和角質化細胞按濃度5 000個/孔加入到96孔板中，在溫度為37 ℃，體積分數為5%的CO2培養箱中培養12 h。在培養后的2種細胞的96孔板中每孔加入100 μL纖維浸提液，空白組加入等體積細胞完全培養基。然后分別在第1、3、5天取出96孔板，并往孔板中加入10 μL MTT繼續培養3.5 h，然后取出孔板并用移液槍吸去孔內液體，并在每孔加入100 μL DMSO用于測試，其中測試吸光度為490 nm[14-15]。 然后根據下式計算細胞的相對增殖率：

式中：As為樣品吸光度；Av為空白組吸光度。

細胞遷移實驗。將人體皮膚成纖細胞和角質化細胞按照濃度1×106個/孔接種到3 cm培養板中，于溫度為37 ℃，體積分數為5% CO2的培養箱中培養。待細胞長滿90%后，用20 μL規格的吸液管分別在培養板中劃痕，并用移液槍吸去培養板中的細胞完全培養基，然后往培養板中加入3 mL浸提液，空白對照組加入等體積細胞完全培養基。在固定時間間隔內，取出培養板，用倒置顯微鏡觀察細胞遷移情況。

1.4.6纖維溶脹性能與降解性能表征

室溫下將3種纖維敷料分別浸漬在磷酸鹽緩沖液中，在固定時間間隔內取出樣品，用濾紙充分吸除纖維表面多余水分，稱其質量變化。用質量變化率來表示纖維溶脹性能，其計算公式為

S=[(ms-mi)/mi]×100%

式中：ms為溶脹后質量，g；mi為溶脹前質量，g。

在相同處理條件下，在固定時間間隔內取出樣品，充分脫水干燥，稱其質量變化。用質量損失率來表示纖維降解性能，其計算公式為

F=[(m0-m1)/m0]×100%

式中：m0為未浸漬前質量，g；m1為降解后質量，g。

1.4.7力學性能測試

在溫度為20 ℃，相對濕度為65%條件下，采用高強高模纖維強伸度儀對藻酸鹽基纖維敷料力學性能進行測試，拉伸隔距為10 mm，預加張力為0.5 cN，拉伸速度為20 mm/min。

2 結果與討論

2.1 纖維表觀形貌分析

采用掃描電子顯微鏡對紡制的3種纖維敷料表面形態進行觀測，結果如圖1所示。海藻酸鹽纖維敷料表面較光滑，并無顆粒及孔隙結構，而海藻酸/羥基磷灰石和海藻酸/二氧化硅復合纖維表面呈現許多圓形顆粒，經放大觀察發現纖維表面存在許多孔隙結構，且嵌入的納米羥基磷灰石和二氧化硅顆粒都均勻地覆蓋在纖維表面，可對纖維吸濕溶脹、降解性能及力學性能產生一定影響。

圖1 海藻酸鹽基纖維敷料的掃描電鏡照片(×200)Fig.1 SEM images of alginate-based fibrous dressings(×200)

2.2 纖維化學結構分析

圖2 纖維敷料的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of fibrous dressings

2.3 鈣-鈉元素含量分析

為進一步證明二氧化硅和羥基磷灰石顆粒的加入阻礙了纖維中Ca2+與溶液中Na+的交換，減緩纖維降解速率，延長降解時間，故對纖維中鈣-鈉元素含量進行測定分析。表2、3分別示出3種纖維敷料中鈉元素和鈣元素含量。可知，纖維中鈉元素含量與纖維降解及溶脹速率呈正相關關系，而鈣元素含量與降解及溶脹速率呈反相關關系。整個降解過程中，純海藻酸鹽纖維中鈉元素含量最高，鈣元素含量最低，說明該纖維中鈣-鈉離子交換度最大，導致其呈現最大吸濕溶脹度和降解度。反之，海藻酸/羥基磷灰石復合纖維呈現最小鈉含量及最大鈣含量，對應于其最小溶脹度及降解度。

2.4 體外生物礦化研究分析

圖3示出海藻酸/二氧化硅和海藻酸/羥基磷灰石復合纖維敷料的礦物沉積圖。由圖1中3種纖維SEM照片可知，海藻酸/二氧化硅及海藻酸/羥基磷灰石復合纖維敷料表面呈現許多圓形晶體，這是因為二氧化硅的加入，形成的帶正電荷硅酸鈣和模擬體液中負電荷磷酸根相互作用，最終形成羥基磷灰石沉積在纖維表面。從圖中纖維的XRD圖譜可知，X衍射峰對應于羥基磷灰石所屬標準卡片JCPDS # 09-0432。

表2 纖維敷料中鈉元素含量Tab.2 Na content in fibrous dressings

表3 纖維敷料中鈣元素含量Tab.3 Ca content in fibrous dressings

圖3 礦物沉積的XRD圖譜Fig.3 XRD patterns of mineral deposit of fibrous dressings

2.5 細胞毒性分析

海藻酸鹽纖維敷料作為醫用衛生材料，對細胞毒性的評價極其重要。本文采用人體皮膚成纖細胞和角質化細胞為研究對象，通過觀察細胞增殖和遷移情況，來評判材料生物毒性。圖4示出人體皮膚成纖細胞相對增長率。

圖4 纖維敷料浸提液處理的人體皮膚成纖維細胞相對增長率Fig.4 Relative growth rate of fibroblasts treated with fibrous dressings extracted medium

圖5示出角質化細胞相對增長率。從圖可知，實驗組OD490均大于空白對照組(編號為CT)，即人體皮膚細胞經實驗組浸提液處理后的細胞存活率大于對照組。海藻酸、海藻酸/二氧化硅和海藻酸/羥基磷灰石纖維敷料所對應的成纖細胞和角質化細胞相對增長率均大于75%,根據細胞毒性評級標準[14-15]可證明材料無生物毒性。

圖5 纖維敷料浸提液處理的人體皮膚角質化細胞相對增長率Fig.5 Relative growth rate of keratinocytes treated with fibrous dressings extracted medium

體外人工模擬劃痕刮傷實驗用于表征材料對皮膚細胞遷移性能影響，進一步評價纖維敷料的細胞毒性。成纖細胞和角質化細胞遷移實驗結果分別如圖6、7所示。

圖6 經SA, SA/HAP和SA/SiO2處理過的成纖維細胞劃痕區域的遷移結果Fig.6 Fibroblast migration in scratched fibroblast free area after treated with SA, SA/HAP and SA/SiO2 extracted medium incubated for 1, 3 and 5 d

圖7 經SA, SA/HAP和SA/SiO2處理過的角質化細胞劃痕區的遷移結果Fig.7 Keratinocyte migration in scratched keratinocyte free area after treated with SA, SA/HAP and SA/SiO2 extracted medium incubated for 1, 3 and 5 d

由圖6可知，經3種纖維敷料浸提液處理過的成纖細胞刮傷劃痕，24 h 后長滿90%，48 h后基本全部長滿。圖7顯示，纖維敷料浸提液處理的角質化細胞刮傷劃痕區48 h后長滿70%，72 h后長滿90%。實驗組人體皮膚成纖細胞及角質化細胞遷移速率和空白對照組相同，由此可知，本文紡制的海藻酸鹽基纖維敷料對皮膚細胞無細胞毒性。

2.6 溶脹性能與降解性能分析

圖8示出3種纖維敷料的溶脹度及降解度。

圖8 纖維敷料的溶脹度和降解度Fig.8 Swelling behavior (a) and degradation performance (b) of fibrous dressings

由圖可知，純海藻酸鹽纖維比海藻酸/二氧化硅及海藻酸/羥基磷灰石復合纖維呈現出較大的溶脹性能、較快的降解速率。海藻酸鹽纖維中含有大量的—OH和—COOH，其浸漬在磷酸鹽緩沖液中時，纖維大分子鏈中β-D-甘露糖醛酸(M)基團吸收大量水分，當達到其飽和狀態時，纖維發生部分降解；此時α-L-古羅糖醛酸(G)大分子基團蛋盒結構中與—COOH交聯的Ca2+和溶液中的Na+發生離子交換，吸收更多水分，最終導致“蛋盒”破裂，大量水分子進入到大分子鏈中，纖維發生降解[7]，因此，其降解速率較大。海藻酸/羥基磷灰石復合纖維呈現較低的溶脹和降解性能，這是因為加入的羥基磷灰石顆粒覆蓋在纖維表面，阻礙了水分子浸入內部，使纖維溶脹性能變差，從而降低纖維降解速率。海藻酸/二氧化硅復合纖維中加入的二氧化硅和溶液中的Ca2+形成硅酸鈣鹽。當纖維浸漬在磷酸鹽緩沖液中，帶正電荷的硅酸鈣和帶負電荷的磷酸離子相互作用，最終以磷灰石沉淀沉積在纖維表面，從而降低纖維溶脹及降解性能。

2.7 力學性能分析

纖維初始斷裂伸長率及斷裂應力如表4所示。可看到：純海藻酸鹽纖維斷裂應力最小，斷裂伸長率最大，而含有無機納米顆粒的纖維呈現出較大的斷裂應力及較小斷裂伸長。納米顆粒的加入，可減少纖維弱節點，同時增加纖維剛度。另外，纖維力學性能隨降解時間的延長而逐漸下降，3種纖維敷料的斷裂伸長率和斷裂應力均隨著時間增加而減弱，且纖維降解速率越快，斷裂伸長率和斷裂應力損耗越大。海藻酸/二氧化硅及海藻酸/羥基磷灰石復合纖維在降解過程中有羥基磷灰石沉積在纖維表面，使降解速率減小，纖維剛度增強，最終導致纖維呈現較大斷裂應力和較小斷裂伸長率。

表4 3種纖維敷料的斷裂伸長率和斷裂應力Tab.4 Elongation at break and breaking stress of fibrous dressings

3 結 論

與純海藻酸鹽纖維敷料相比，海藻酸鹽/羥基磷灰石復合纖維敷料及海藻酸鹽/二氧化硅復合纖維敷料的降解度下降20%左右，斷裂應力約增加18%。由此可知，芯層流中加入納米二氧化硅和羥基磷灰石顆粒可降低材料降解速率，延緩材料降解周期，改善其力學性能。另外，無機納米顆粒的嵌入使得纖維敷料表面呈現孔隙結構，有益于營養物質的運輸及組織再生長。由人體皮膚成纖維細胞和角質化細胞增殖及細胞遷移實驗結果可看出，皮膚細胞在纖維敷料浸提液中可維持正常活性如增殖、遷移等，即本文紡制的海藻酸鹽基纖維敷料無細胞毒性。

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