再生絲素蛋白溶液脫鹽新工藝及其應用

李鵬飛， 鄧 樺， 馬 軍， 劉紅斌， 劉珍珠

(1. 天津工業大學 紡織學院， 天津 300387； 2. 軍事醫學科學院 衛生裝備研究所， 天津 300161)

蠶絲主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，其中絲素蛋白作為核心纖維占總質量的75%左右，是提供蠶絲力學性能并且使蠶絲表現出多種優點的主要成分[1]，正逐步應用于化妝品、醫學[2]和生物等多個領域。天然絲素蛋白不溶于水，目前采用溶解—精制后再加以利用，對于絲素蛋白的溶解工藝已有大量報道，目前主要是采用CaCl2-EtOH-H2O三元體系來溶解絲素，絲素溶解后，由于高濃度鹽的存在使其無法被進一步利用，所以脫鹽是實現絲素蛋白在其應用領域產業化的關鍵問題之一。

近年來人們對絲素蛋白溶液脫鹽的方法進行不斷的研究改進，傳統上采用的是透析袋脫鹽[3]，該方法耗時長，耗水多。隨著膜分離技術的發展，有研究人員利用超濾、納濾和電滲析等技術[4-6]進行絲素蛋白溶液的脫鹽。雖然3種方法優于透析袋脫鹽[7]，但是仍然存在著脫鹽效率低、脫鹽時間長，耗能嚴重等問題。

傳統脫鹽工藝的低效嚴重制約著絲素蛋白溶液的規模化使用，為了促進絲素蛋白溶液的工業化生產，本文探討并優化一種絲素蛋白溶液(以下稱為料液)的新型脫鹽工藝，即擴散滲析-電滲析集成脫鹽工藝，并且將該工藝條件下制備的高純度的絲素蛋白溶液制成絲素蛋白粉，進一步探索該工藝所得產品的應用性能。本文所涉及到的2種膜堆，其中擴散滲析膜堆利用擴散滲析膜兩側溶液的濃度差為推動力來實現脫鹽；電滲析膜堆則是在外加電場的作用下通過離子的定向遷移實現脫鹽。二者結合對絲素蛋白溶液進行脫鹽，既可充分利用絲素蛋白溶液本身的高鹽濃度，又可利用電場作用來提高脫鹽效率，從而達到既高效又節能的目的。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

材料：蠶絲(市購)，碳酸鈉、無水氯化鈣(塊)、無水乙醇、鹽酸、氯化銨、結晶硫酸鎂、無水硫酸鈉、氨水、鋅粒、乙二胺四乙二鈉鹽、絡黑T、無水乙醇，以上均為分析純。

儀器：TD系列電子天平；DHG-9055型A烘箱；D-8401型多功能攪拌器；電熱恒溫水浴鍋；YZ1515x型蠕動泵；85-2型恒溫磁力攪拌器；DDSJ-308F型電導率儀；CR22G型超速冷凍離心機；121 MB型氨基酸自動分析儀；TM-3030型臺式掃描電子顯微鏡。

擴散滲析模塊：外形尺寸為100 mm×200 mm，有效尺寸為70 mm×120 mm，厚度為0.5 mm，擴散滲析陽膜，膜對數量為10，流量范圍為20～40 L/h。

電滲析模塊：外形尺寸為100 mm×200 mm，有效尺寸為70 mm×120 mm，厚度為0.5 mm，均相陰陽離子交換膜，膜對數量為10，操作電壓5 V，流量范圍為20～40 L/h。

1.2 不溶性絲素蛋白粉制備工藝

生蠶絲經脫膠、溶解，離心除雜后用擴散滲析-電滲析集成工藝脫鹽，得到純度較高的絲素蛋白溶液，將溶液中加入無水乙醇[8]，所得白色沉淀經干燥后得到不溶性絲素蛋白粉。

1.2.1蠶絲脫膠與溶解

將蠶絲在溫度為100 ℃，浴比為1∶40條件下，用質量濃度為5 g/L的Na2CO3溶液脫膠3次，每次30 min，除去絲膠蛋白，于50 ℃下烘干，得到脫膠蠶絲。按照物質的量比1∶2∶8配制氯化鈣-乙醇-水(CaCl2-EtoH-H2O)三元體系溶液，以脫膠后蠶絲與三元體溶液質量比為1∶15,在60 ℃恒溫水浴鍋中對脫膠后的蠶絲溶解4 h，溶解后，待絲素蛋白溶液冷卻至室溫后用離心機8 000 r/min，離心10 min，得到絲素蛋白溶液。

1.2.2絲素蛋白溶液脫鹽

取0.1 L所制備的絲素蛋白溶液，稀釋至一定濃度，配制成料液。準確量取1 L去離子水為滲透液(料液與滲透液體積比為1∶10)，然后將料液與滲透液分別以流量為40、20 L/h[9]通入擴散滲析模塊，進行第1階段預脫鹽。待脫鹽至一定脫鹽率時，設置電流為0.2 A[9]，料液和滲透液流量不變，進行第2階段電滲析脫鹽，至溶液電導率降至200 μS/cm，此時脫鹽結束。其中料液和滲透液均由蠕動泵循環供給。

1.2.3不溶性絲素蛋白粉制備

取一定體積的絲素蛋白溶液，調制至質量分數為5%，在室溫下加入適量無水乙醇，溶液中會迅速產生白色沉淀，靜置至待沉淀不再產生時，過濾取沉淀，經干燥后得到不溶性的絲素蛋白粉。

1.3 測定與計算方法

溶液總溶解固體(TDS)值通過臺式電導率儀進行測定。Ca2+含量采用EDTA滴定法[10]測定。計算公式為

N=T×V

β=(mi/mj)×100%

θ=(m1/m0)×100%

W=U×I×t

式中：N為實際離子總量，g；T為溶液TDS值，g/L；V為溶液的體積，L；β為脫鹽率，%；mi為滲透液中含鹽量，g；mj為脫鹽前料液中含鹽量，g；θ為絲素蛋白回收率，%；m1為脫鹽后料液中蛋白質質量，g；m0為脫鹽前料液中蛋白質質量，g；W為電滲析能耗(動力能耗除外)，kWh；U為操作電壓，V；I為操作電流，A；t為操作時間，h；η為料液體積增長率，%；V0為料液初始體積，L；Vn為nh時料液體積，L。

其中，脫鹽前料液中蛋白質含量用溶解的絲素蛋白質量來衡量，而脫鹽后蛋白質含量用脫鹽后的料液經干燥后所剩余固體質量來衡量。

氨基酸含量測定：將絲素蛋白樣品放置于水解管中，加入適量的6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在110 ℃下水解24 h，冷卻后定容、過濾、蒸干，再加入0.02 mol/L的HCl溶液，并在空氣中放置30 min，上機測定氨基酸含量。

利用TM-3030型臺式掃描電子顯微鏡觀察不溶性絲素蛋白粉的微觀形貌。

2 結果與討論

2.1 料液質量分數的選擇

在使用CaCl2-EtOH-H2O三元體系溶解絲素蛋白過程中，Ca2+會配位在絲素蛋白大分子鏈的絡氨酸、絲氨酸的側鏈羥基處，形成螯合物[11]，這說明絲素蛋白溶液中Ca2+分為2部分：一部分是游離在溶液中的Ca2+，可對溶液的TDS值產生影響；另一部分由于與絲素蛋白螯合而沒有對溶液的TDS值產生影響。這2部分Ca2+會隨著溶液質量分數的不同而產生變化。有研究者通過對絲素蛋白溶液質量分數和TDS值關系的研究，發現隨著質量分數的增加溶液TDS值先增大后減小且在3%時TDS值達到最大，再而考慮到水的反向滲透，最終選擇絲素蛋白溶液進液質量分數為4%[12]，但是這個結果對料液體積的變化情況考慮的并不充分，如圖1所示。

圖1 料液體積增長百分率與時間的關系Fig.1 Relationship between percentage of volume growth and time

由圖1可知，在脫鹽過程中，由于水的反向滲透，料液體積逐漸增加且增長率可達到80%左右，料液體積稀釋的程度較大。可見僅考慮4%的質量分數顯然是不夠的，因此選擇料液質量分數為5%、4%和3%進行第1階段擴散滲析預脫鹽實驗，結果見圖2。

圖2 不同料液質量分數下時間和脫鹽率的關系Fig.2 Relationship between concentration of liquid and time and desalination rate

由圖2可知，達到相同脫鹽率時料液質量分數為5%的曲線用時最短，由圖中曲線的斜率可知3種質量分數料液在0～4 h內脫鹽效率較高。結合圖1可知，當料液初始質量分數為5%時，料液質量分數將由5%降至2.8%左右，在此期間脫鹽效率逐漸提升然后再下降，而初始質量分數為4%時，進行到1 h時料液質量分數已被稀釋至3.0%左右，此后長時間內脫鹽效率逐漸下降。

綜合考慮圖1和圖2，選定料液質量分數5%為最佳，此時不僅濃度差推動力較大，而且最終得到的絲素蛋白溶液質量分數也較大，不溶性絲素蛋白粉的產率也相應較高。

2.2 擴散滲析預脫鹽率的選擇

隨著脫鹽過程的進行，料液中的CaCl2逐漸滲析至滲透液中，致使料液和滲透液的鹽的質量分數差越來越小，脫鹽效率會逐漸降低，此時溶液體系會較長時間地處于料液鹽的質量分數高于滲透液鹽濃度的狀態，而且隨著這段時間的延長，滲透液向料液中反向滲透的水會增加，這就會造成料液質量分數逐漸減小，從而會減少不溶性絲素蛋白粉的產率，但是若過大的縮短擴散滲析預脫鹽時間，又會增加電滲析脫鹽時間，這樣會造成能耗增加；因此選定料液進液質量分數為5%，分別進行擴散滲析和電滲析脫鹽實驗，結果如圖3所示。

圖3 不同脫鹽方式下時間和脫鹽率的關系Fig.3 Relationship between different desalination methods and desalting rate and time

由圖3可知，電滲析脫鹽所得到的是一條斜率基本不變的直線，而擴散滲析脫鹽所得到的是一條斜率逐漸減小的曲線，表明前者的脫鹽效率基本不受料液和滲透液之間濃度差的影響，而后者的脫鹽效率隨著料液和滲透液之間質量分數差的減小而下降。相同時間內，2種脫鹽方式在脫鹽率為60%左右差距變得越來越大。

選擇預脫鹽率分別為20%、40%、60%進行脫鹽實驗，結果如表1所示。

表1 不同預脫鹽率脫鹽實驗結果Tab.1 Experimental results of desalting at different pre-desalting rates

由表1可知，不同預脫鹽率對脫鹽時間和能耗的影響較大，對最后所得溶液的質量分數影響較小。表中最終所得濃度比圖1的分析中所提到的質量分數高，因為圖1、2的數據是擴散滲析預脫鹽階段的數據，在預脫鹽結束后要進行電滲析深度脫鹽，此時料液中鹽濃度要長時間處于低于滲透液中鹽質量分數的狀態，料液中的水會透過交換膜向滲透液中轉移，因此會對料液達到初步濃縮的效果，且會隨著電滲析脫鹽時間的延長濃縮效果更加明顯。

當預脫鹽率為60%時，雖然能耗相對來說比較低，但是最終脫鹽時間和料液質量分數是最不理想的；當預脫鹽率為40%時，雖然脫鹽時間比20%時長，但是此時能耗較小，而且相比于傳統的透析袋來說，已經將脫鹽時間由36 h縮短到了9.78 h。綜合考慮，當預脫鹽率為40%時，脫鹽工時短，能耗小且此時溶液質量分數較佳。

2.3 絲素蛋白氨基酸組成

對脫鹽后所得絲素蛋白進行氨基酸含量分析，100 g絲素蛋白中：組氨酸0.41%、賴氨酸0.49%、苯丙氨酸1.50%、天門冬氨酸2.69%、蘇氨酸1.13%、絲氨酸12.60%、酪氨酸10.74%、亮氨酸0.62%、異亮氨酸1.88%、纈氨酸3.81%、甘氨酸36.55%、丙氨酸27.85%、谷氨酸2.41%。

由以上數據可看出甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和絲氨酸約占總組成的87%，很多功能性實驗證實了這4種氨基酸以及其所構成的多肽都具有優良的生理功能，其中含量最高的甘氨酸可以很好地吸收紫外線，另外占總含量12.60%的絲氨酸不僅可與紫外線進行光化反應，還可有效地抑制黑色素的形成。

2.4 絲素蛋白結構分析

將絲素蛋白溶液直接冷凍干燥得到絲素蛋白粉樣品A，取一定體積絲素蛋白溶液加入適量無水乙醇，得到白色沉淀，經干燥后得到樣品B。利用掃描電鏡(SEM)分別對樣品A、B進行觀察，結果如圖4所示。

圖4 絲素蛋白粉掃描電鏡照片(×500)Fig.4 SEM images of silk fibroin powder(×500).(a)Sample A；(b)Sample B

對比圖4(a)、4(b)可知，樣品A呈塊狀，粒徑較大，樣品B的顆粒直徑明顯小于樣品A，而且顆粒大小均勻，表面具有細小的凹凸孔洞，增大了比表面積，會增加對紫外線的散射，使其對紫外線具有更好的阻擋防護作用。樣品B用于化妝品中可更加均勻地鋪展到皮膚表面，另外由于絲素蛋白本身具有良好的親和性，不會造成皮膚過敏，而且由于較小的粒徑，即使進入了皮膚的毛孔也會被分解吸收。

3 結 論

本文旨在解決絲素蛋白溶液制備過程中存在的耗時和耗能等問題，通過對主要影響因素的分析研究，最終得到了較為滿意工藝條件，初步達到了高效節能的項目預期，其中：

1)確定了擴散滲析-電滲析集成脫鹽工藝參數：料液質量分數為5%，擴散滲析預脫鹽率為40%，在此工藝條件下進行絲素蛋白溶液的脫鹽可以進一步降低脫鹽能耗，縮短脫鹽工時。

2)測定了絲素蛋白的氨基酸組成，并且利用掃描電鏡觀察不溶性絲素蛋白粉的形貌特征。由氨基酸分析可看出絲氨酸和甘氨酸含量總和接近50%，由電鏡掃描得到不溶性絲素蛋白粉的粒徑較小且分布均勻，因此不溶性蠶絲蛋白粉不僅可以吸收一部分紫外線，還可以散射一部分紫外線，用在化妝品中既能被皮膚吸收，又具有很好的防曬功能。

參考文獻：

[1] 倪莉, 王璋, 許時嬰. 可溶性絲素粉末的制備[J].無錫輕工大學學報, 2000(2):146-149.

NI Li, WANG Zhang, XU Shiying. Preparation of silk fibroin powder[J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 2000(2):146-149.

[2] ZHU M, WANG K, MEI J, et al. Fabrication of highly interconnected porous silk fibroin scaffolds for potential use as vascular grafts [J]. Acta Biomater, 2014, 10:2014-23.

[3] TUNA Y, PEGGY C, DAVID L, et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels [J]. Biophysical Journal, 2009, 97(7): 2044-2050.

[4] 蘇鋒, 楊瑞金, 許時嬰. 可溶性絲素蛋白溶液脫鹽技術[J]. 無錫輕工大學學報,2004(4):56-59.

SU Feng, YANG Ruijin, XU Shiying. Soluble silk fibroin solution desalination technology [J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 2004(4):56-59.

[5] 周鳳娟, 許時嬰, 楊瑞金, 等. 納濾技術在絲素活性肽生產中的應用[J]. 膜科學與技術,2008(3):83-86,99.

ZHOU Fengjuan, XU Shiying, YANG Ruijin, et al. Application of nanofiltration technology in the production of silk fibroin bioactive peptides[J]. Membrane Science and Technology, 2008(3):83-86,99.

[6] 中國科學院上海有機化學研究所. 絲肽、制備方法和應用: 103897021A[P]. 2014-07-02.

Shanghai Institute of organic chemistry, Chinese Academy of Sciences. Silk peptide, preparation method and application: 103897021A[P]. 2014-07-02.

[7] 周鳳娟, 許時嬰, 楊瑞金, 等. 滲析分離絲素蛋白鹽溶液的研究[J]. 膜科學與技術, 2004(6):25-28.

ZHOU Fengjuan, XU Shiying, YANG Ruijin, et al. Study on the separation of fibroin solution by dialysis[J]. Membrane Science and Technology, 2004(6):25-28.

[8] 袁慧勇. 不溶性蠶絲蛋白超細粉的制備及應用[D]. 保定：河北大學,2010:8-9.

YUAN Huiyong. Preparation and application of insoluble silk protein superfine powder [D]. Baoding: Hebei University, 2010:8-9.

[9] 劉珍珠, 劉紅斌, 鄧樺, 等.可溶性絲素蛋白新型脫鹽工藝研究[J]. 水處理技術,2017(4):62-65.

LIU Zhenzhu, LIU Hongbin, DENG Hua, et al. Study on new desalting process of soluble silk fibroin [J]. Water Treatment Technology, 2017(4): 62-65.

[10] 劉二東, 鄭斌. 配位滴定法測定生活用水的硬度[J]. 山東化工,2016(17):79-80,83.

LIU Erdong, ZHENG Bin. Determination of hardness of domestic water by complexometric titration [J]. Shandong Chemical Industry, 2016(17): 79-80,83.

[11] 董文秀,李軍生,李秋杰,等. 光譜法研究鈣離子對絲素蛋白溶解過程中結構的影響[J]. 分析測試學報,2014,12:1410-1415.

DONG Wenxiu, LI Junsheng, LI Qiujie, et al. The spectrum method to study the structure of the calcium ion in the process of silk fibroin dissolve effect [J]. Journal of Analysis Test, 2014, 12:1410-1415.

[12] 劉珍珠. 絲素蛋白溶液的脫鹽技術研究及其在紡織上的應用[D].天津：天津工業大學,2017:22-25.

LIU Zhenzhu. Study on desalination of silk fibroin solution and its application in textile[D].Tianjin: Tianjin Polytechnic University,2017:22-25.