高糖刺激大鼠腎間質成纖維細胞TGF-β、CTGF及α-SMA作用研究

韓 璐，胡 濤，丁雪峰，楊 玉

(吉化集團公司總醫院 1.檢驗科;2.內分泌科,吉林 吉林132000)

腎間質成纖維細胞作為腎間質的固有細胞，是腎臟細胞外基質(ECM)的主要生成細胞，約占腎組織細胞總數的6%。研究表明，在高糖等因素作用下，正常腎臟中相對靜止的成纖維細胞可被激活，表現出明顯增殖活性，同時刺激合成多種ECM成分，包括膠原(collagen)、纖連蛋白(FN)、彈性蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖等，參與腎間質纖維化過程。轉化生長因子-β(TGF-β)、結締組織生長因子(CTGF)被認為是強效的致纖維化因子，在多種組織器官纖維化中起重要作用。大量研究顯示，二者在腎間質纖維化發生發展中也具有重要作用[1,2]。有學者認為，活化的成纖維細胞可發生功能和表型改變，即轉變為可表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維細胞(MFB)，后者數量的多少與間質纖維化輕重程度密切相關，可以作為判斷慢性腎臟疾病一個很好的指標[3]。本研究旨在探討高糖對大鼠腎間質成纖維細胞株NRK49f TGF-β、CTGF及α-SMA表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料大鼠腎間質成纖維細胞株NRK49f購自上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖及低糖培養基為Invitrogen產品，胎牛血清產自天津灝洋生物技術公司。兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記抗兔多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。ECL顯色試劑盒為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產品。細胞裂解液、Bradford 法蛋白檢測試劑盒由碧云天生物技術公司生產。TRizol為Invitrogen產品，二步法實時定量逆轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒為全式金生物技術公司產品。

1.2細胞分組將處于對數生長期的細胞按1×106/孔接種至6孔板，待細胞完全貼壁后，將培養細胞換用無血清DMEM培養12 h后，用無血清高糖DMEM繼續培養12 h、24 h及48 h，同時設空白對照組，即繼續用無血清DMEM培養相應時間。每組設3個復孔，實現重復3次。

1.3WesternBlot檢測各組細胞于培養結束后，吸取培養上清并用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌細胞2次，每孔加300 μl細胞裂解液反復吹打以充分裂解細胞，經蛋白定量后按50 μg/孔行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳并經轉膜、洗膜、封閉后，用兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗體4℃孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標記抗兔多克隆抗體37℃孵育2 h，充分洗膜后用ECL法顯色、曝光后測量X光膠片上條帶密度。

1.4實時定量RT-PCR檢測各組細胞于培養結束后，吸取培養上清并用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌細胞2次后，按TRizol說明書提取細胞總RNA，并二步法實時定量RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄并用TGF-β、CTGF及α-SMA特異性引物進行PCR反應。按2-ΔΔCt計算各組細胞TGF-β和CTGF的相對表達量，ΔΔCt=(實驗組目的基因Ct-實驗組內參基因Ct)-(對照組目的基因Ct-對照組內參基因Ct)[4]。

PCR引物序列分別為：TGF-β正意義鏈5’-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3’， 反意義鏈5’-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG-3’；CTGF正意義鏈5’-CTAAGACCTGTGGAATGGGC-3’， 反意義鏈5’-CTCAAAGATGTCATTGCCCCC-3’。以GAPDH為內參照，引物序列為正意義鏈5’-ACTGAGCATCTCCCTCAC-3’， 反意義鏈5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

2 結果

2.1各組細胞TGF-β和CTGFwesternblot檢測結果高糖DMEM作用于NRK49f 12 h即可見TGF-β、CTGF蛋白表達均有增加趨勢，并持續增高，與正常對照組比較，高糖刺激24 h及48 h組TGF-β相對表達量均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，且與高糖12 h組比較，二者相對表達量變化明顯增加(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 各組細胞TGF-β和CTGF western blot檢測結果

表1 各組細胞TGF-β和CTGF western blot檢測結果

2.2各組細胞TGF-β和CTGF實時定量RT-PCR檢測結果高糖DMEM作用于NRK49f 12 h即可見TGF-β、CTGF mRNA表達均增加，隨培養時間的延長，二者表達量持續增加，至高糖刺激培養細胞24 h及48 h時，二者相對表達量均明顯高于對照組及高糖培養12 h組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞TGF-β和CTGF 實時定量RT-PCR檢測結果

2.3各組細胞α-SMA表達檢測結果Western blot檢測結果顯示，正常組NRK49f細胞未檢測到α-SMA表達，高糖DMEM作用于NRK49f 24 h時可見α-SMA表達條帶，至高糖DMEM培養48 h時，α-SMA表達量明顯高于24 h高糖DMEM培養組，見圖2。

圖2 各組細胞α-SMA表達檢測結果

3 討論

腎間質纖維化是各種原因所致腎臟損傷的最終結果，腎間質成纖維細胞是腎間質纖維化的主要效應細胞。研究表明，糖尿病腎病大鼠腎間質中成纖維細胞明顯增生及ECM生成，腎間質TGF-β、CTGF蛋白及mRNA表達亦明顯增加[5,6]。李海劍等[7,8]通過體外實驗證明，高糖可刺激腎間質成纖維細胞增殖及ECM表達。這些研究表明高糖可引發或加速腎間質纖維化進程。

TGF-β分子量25 kD，由兩個分子量為12.5 kD的亞基通過二硫鍵連接而成的同源二聚體，二聚體形式的TGF-β才有生物活性。現已證明，TGF-β是腎間質纖維化過程中最重要的生長因子之一，在腎間質纖維化發生、發展的多個環節起作用。研究表明，TGF-β除直接刺激腎間質成纖維細胞ECM產生外，還可通過促進纖溶酶原激活物抑制物(PAI)和基質金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)的合成而減少ECM降解。CTGF是在TGF-β下游起作用的介質。在CTGF啟動子上有一個特殊的TGF-β反應元件，TGF-β通過此元件誘導CTGF表達，促進腎間質纖維化的形成。黃海長等[9]的研究發現，CTGF可修飾或放大TGF-β1的促成纖維細胞生成作用。本研究中，高糖培養液作用于NRK49f 12 h即可見其TGF-β和CTGF的表達增加，并隨培養時間的延長而繼續增加，至24 h和48 h時，培養細胞TGF-β和CTGF的表達已明顯高于對照組，表明在體外，高糖可明顯刺激腎間質成纖維TGF-β和CTGF的轉錄和翻譯水平。

α-SMA是常用的肌細胞特異性表達蛋白，常用于平滑肌細胞的鑒定。有研究發現，TGF-β、CTGF均可刺激大鼠腎臟成纖維細胞合成向肌成纖維細胞轉分化，即由本來不表達α-SMA的腎小管成纖維細胞轉分化為有α-SMA表達的肌成纖維細胞。本研究中，高糖刺激NRK49f 24 h后，NRK49f出現α-SMA的表達，表明其向肌成纖維細胞轉分化。

綜上所述，高糖可刺激體外培養的腎間質成纖維細胞表達TGF-β和CTGF的轉錄和翻譯，并可刺激其表達α-SMA，這可能是糖尿病腎病致腎間質纖維化的機制之一。

參考文獻：

[1]Lam S,van der Geest RN,Verhagen NA,et al.Secretion of collagen type IV by human renal fibroblasts is increased by high glucose via a TGF-beta-independent pathway[J].Nephrol Dial Transplant,2004,19(7):1694.

[2]Wang S,Denichilo M,Brubaker C,et al.Connective tissue growth factor in tubulointerstitial injury of diabetic nephropathy[J].Kidney Int,2001,60(1):96.

[3]Chao LK,Chang WT,Shih YW,et al.Cinnamaldehyde impairs high glucose-induced hypertrophy in renal interstitial fibroblasts[J].Toxicol Appl Pharmacol,2010,244(2):174.

[4]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod[J].Methods,2001,25(2):402.

[5]安 娜,劉惠蘭,王 英.2型糖尿病腎病大鼠腎小管間質病變及TGF-β1、HGF和CTGF表達的變化及意義[J].首都醫科大學學報,2008,29 (3):315.

[6]張樹華,孫 冬,梅馬琳,等.糖尿病大鼠腎臟纖維化與CTGF表達的相關性[J].中國循證心血管醫學雜志,2013,5(2):190.

[7]程根陽,劉章鎖,李海劍.羅格列酮對高糖環境大鼠腎臟成纖維細胞影響[J].醫藥論壇雜志,2009,19:12.

[8]鄭朝暉,李海劍,劉章鎖.羅格列酮對高糖環境下腎臟成纖維細胞表達細胞外基質的影響[J].中華腎臟病雜志,2006,22(9):574.

[9]楊 敏，黃海長，李驚子,等.結締組織生長因子增強轉化生長因子β-1促成肌纖維細胞生成的分子機理研究[C].“中華醫學會腎臟病學分會年會”暨“全國中青年腎臟病學術會議”,2004.