實驗室檢測與校準的方法驗證和方法確認

康 婕

（陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安 710048）

0 引言

檢測方法是一項檢測技術程序，是實驗室管理體系中技術要求的一個重要要素，是實驗室管理體系中過程要求的一項核心要素。實驗室可以選擇的檢測方法有標準方法和非標方法。標準方法需要進行驗證工作，而非標方法則需要開展確認工作。然而，許多實驗室的檢測人員不能完全理解方法確認和方法驗證的概念，所以對方法驗證和方法確認進行系統性論述，旨在為檢測實驗室進行驗證和確認提供參考。

1 方法驗證和方法確認的區別

1.1 概念

ISO/IEC 99—2007指南，2.44中規定“方法驗證是實驗室通過核查，提供客觀有效證據證明滿足檢測方法規定的要求”；ISO/IEC 99—2007指南，2.45中規定“實驗室通過試驗，提供客觀有效證據證明特定檢測方法滿足預期的用途”[1]。準確地講，方法驗證著重于檢測方法會不會用，方法確認則著重于該檢測方法能不能用。

1.2 目的

由概念可以看出，方法驗證旨在實驗室是否有能力按標準方法開展實驗室活動（包括檢測、校準和抽樣），主要著重于能否出具充分的客觀依據。方法確認則主要看該非標方法是否能合理、合法使用。

1.3 范圍

方法驗證是實驗室內方法驗證。方法確認包括實驗室內方法確認和實驗室間方法確認。方法確認的研究領域要比方法驗證廣得多。

1.4 時機

方法驗證是在實驗室引入檢測與校準之前證實運用標準方法的正確性，方法確認應在首次使用非標方法（書、期刊、一起） 之前確認，方法實施（新的基質、檢測儀器變化、樣品前處理變化等）或者工作環境發生了改變，或長期停用后的再確認，當方法偏倚時也應當進行確認。

1.5 對象

方法驗證適用于標準方法，標準方法是由公認機構通過評價確認之后向社會公開頒布的技術規范文件，包括：①國內標準（國家標準、行業標準和地方標準）；②國際標準（如ISO，IEC，ITU等頒布的標準）；③區域標準（如歐洲標準化委員會（CEN）等頒布的標準）；④國外標準（如ANSI，DIN，BSI等頒布的標準）。

方法確認適用于：①非標方法；②實驗室設計（制定）的方法；③超出其預定范圍使用的標準方法（例如，當檢測標準要求測定物含量需小于1%，而實際待測物為8%～12%，實驗室采用該標準對待測物進行了檢測，這就是超出標準要求范圍進行的檢測，所獲得的結果依然是準確且有效的）；④擴充和修改過的標準方法[2]（例如，一則標準是應用于飲料中某項指標的檢測，細微修改后用來當作白酒中某項指標的檢測，對檢測結果進行有效性評估后發現測試數據準確有效，則此修改過的標準方法可靠有效）。方法確認應盡可能全面，以滿足預定用途或應用領域的需要。但是以下幾種情況不需要再進行確認：①知名技術組織公布的、國際上普遍采用、行業廣泛認可的某些公司或者行業協會的標準，通常可以不進行確認而直接使用；②對于獲得政府、行業組織承認的非標準方法可直接證實使用，不需進行確認；③對科學書籍和期刊公布的方法，若是國際普遍采用或行業廣泛認可的，可以直接證實使用；④對于儀器供應商提供的方法，若檢測與校準對象跟其描述的類型、范圍相同，且該方法為行業內公認，則可直接證實使用。

2 方法驗證和方法確認的內容

2.1 方法驗證

通常而言，實驗室在新檢測標準投入使用前或者已經確認過的方法出現微小改動時（如改變稀釋了濃度指標，選用不同廠家的柱子等） 需要進行方法驗證，進行驗證時需要從人力資源、設備、環境條件、試劑等幾個方面去驗證是否有能力開展實驗室活動（包括檢測、校準和抽樣），當綜合考量上述條件均滿足檢測的要求后，還需進一步驗證實驗室是否有能力滿足標準方法的要求。如何進行實驗室驗證依賴于檢測目標物的種類和實驗室手段的性質。關注基礎參數（如回收率、線性、精密度、不確定度等）是否能達到實驗室標準要求。

2.2 方法確認

方法確認工作不是一項偶然行動，是經過計劃和準備的。方法確認的內容應該廣泛且全面，以滿足預定用途或應用領域的需要。標準方法的確認準則是：所用的人員、設備、試劑、環境等以證明實驗室能夠正確使用該新標準實施檢測過程，確定技術路線和相關參數。非標方法的確認通常從以下5個方面確認。

（1）使用標準物質進行比較或者評定偏差和精度。應選擇合適的標準物質（標準物質應該滿足其準確度，應該優于擬確認方法的準確度；標準物質的種類、濃度范圍應該與擬確認方法相符合），采用不確定度檢驗法和t檢驗法和回收率檢驗法進行方法確認。在用回收率試驗進行評價時應該注意：加標量應該小于待測物含量的3倍；測定含量在mg/kg級時，回收率含量應該在90%以上，測定含量在μg/kg級時，回收率含量應該在80%以上，如果檢測方法復雜可以低至70%。

（2）與其他方法所得的結果進行比較。可以采用t檢驗（應用t檢驗時，要求被檢驗的2組數據具有相同或者相近的方差）或F檢驗法進行檢驗和判斷方法的顯著性問題。但是應該注意進行t檢驗之前必須先進行F檢驗。

（3）實驗室間比對。利用實驗室間比對進行方法確認，即在同樣條件下利用相同方法進行重復性檢測和改變測試條件時利用不同方法進行復現性檢測，得出重復性限r和復現性限R。

（4）對影響結果的因素作系統性評審。利用對結果的因素做系統性評價——加強性檢驗，對抵御外來影響的穩健度或抵御來自樣品（或檢測物）集體干擾的交互靈敏度進行方法確認。在作系統性評審進行方法確認時可進行配對比較，即固定一因素從而消除其他因素的影響，兩側測量結果用配對數據差值D來進行顯著性檢驗分析。

（5）根據對方法的理論原理和實踐經驗的科學理解，對所得結果不確定度進行的評定。

3 方法驗證和方法確認的參數

對于化學實驗室而言，方法驗證的技術參數有檢出限、回收率、方法標準曲線和精密度試驗。方法確認的技術參數除了有檢出限、回收率、方法標準曲線和精密度試驗外，還需要進行方法特異性（區分同分異構體）、抗干擾性、耐用性和測量不確定度評估[3]。實驗室可在綜合考慮成本、風險技術可行性基礎上，并根據預期的用途進行方法確認，實驗室進行方法確認的內容應盡可能全面且完整，包括但不限于以下方法特性，方法選擇性、方法適用性、回收率、測量范圍或線性范圍、檢出限或定量限，正確度、穩健度、靈敏度、精密度（重復性或復現性）、測量不確定度等。

3.1 檢出限（LOD）

當被檢組分的濃度不是很高，且特性不是很明顯時，基于結果具有最大不確定度的期望時，通過方法檢測所能達到的最低含量叫做檢出限（LOD）。檢出限（LOD）包括方法檢出限（MDL） 和儀器檢出限（IDL），這2個概念不能相互混淆，信噪比可用來考查儀器性能但不適用于評估方法檢出限。方法檢出限是某特定分析方法在給定的置信度內（如95%，99%或99.7%）能檢出待測樣組分的最低含量（最小濃度或者最小量）。這里說的檢出是指定性檢出，即判定樣品中存有濃度高于空白的待測物質，檢出限是一種定性判斷依據。

（1）基于空白標準偏差評估法。當空白樣本的標準偏差不等于0時，獨立測試樣品空白，測定不少于10次，計算檢測結果的標準偏差（S），空白+3倍標準偏差（3S） 即為方法檢出限（MDL）。當空白樣本的標準偏差等于0時，在空白樣品中添加最低可接受的濃度（添加量不少于10次），檢測待測物的濃度，計算標準偏差（S），3倍標準偏差（3S）即為方法檢出限（MDL）。

（2）校準公式適用范圍評估法。利用校準方程的參數來確定檢出限，如果空白平均值+3倍標準偏差（3S），校準方程的截距a為儀器對于空白的響應，儀器響應的標準偏差是校準的標準誤差（Sy/x），利用校準方程：yLOD=a+3Sy/x=a+bxLOD，則xLOD=3Sy/x/b（校準曲線的斜率）得到檢出限。

（3） 確定檢出限的方法。在某些分光光度法中，以口出空白后與0.01吸光度對應的濃度可為檢出限，氣相色譜分析的最小檢測量是指檢測器剛能產生與噪音相區別的響應信號時進入色譜柱的物質的最小量，通常認為剛能辨別的響應信號是噪音的2倍，最小檢測濃度為最小檢測量與進樣量體積的比。

3.2 定量限（LQD）

定量限（LQD） 是指某特定分析方法在給定置信度和允許誤差范圍內能夠從樣品中定量檢出待測組分的最低濃度或最低量。定量限（LQD） 也成定量檢測下限或者報告限，其結果能保證一定的正確度和精密度。但是當待測物的最低濃度或者最低量在檢出限（LOD） 和定量限（LQD） 之間時，準確度就沒有保障，此時檢測結果不一定準確。美國國家標準局定義10倍空白標準偏差（即10σ空）。

痕量分析準則見表1。

表1 痕量分析準則

3.3 線性

對于任何定量的方法，都需要確定被分析物濃度的適用范圍，因此實驗室應該確定檢測方法校準曲線的線性范圍。在線性范圍內信號反應與被分析物的濃度呈線性相關，實驗室建立標準曲線應覆蓋不同濃度（或數量級），6個及其以上（包括空白）校準點，以操作反應信號為y軸，以操作濃度為x軸，制作標準曲線，確定各種濃度的最大和最小的線性范圍。對于篩選方法，線性回歸方程的相關系數要不低于0.98；對于準確定量的方法，線性回歸方程的相關系數要不低于0.99。相性范圍確定時應該盡量滿足以下要求：①校準用的校準點應該覆蓋目標物濃度的50%～150%，如果需要做空白試驗，則應該覆蓋目標物濃度的50%～150%；②校準用的校準點應盡可能均勻分布在目標物濃度內，不同濃度應該獨立配制，不能通過稀釋高濃度校準點配制；③每個校準點至少重復測定2次，建議3次或者更多次。

3.4 精密度

精密度是在規定條件下，獨立檢測結果間的一致程度。精密度說明檢測人員檢測結果的穩定性。精密度的度量通常以不精密度表達，量值用檢測結果的標準差來表示，精密度越低，標準差越大。精密度與真值或者可接受的參考值無關，僅取決于隨機誤差的分布。禁用物質在進行精密度試驗時，應在LOD、2倍LOD和10倍LOD 3個水平進行，對于已經制定最高殘留量（MRL） 的，應在LOD，MRL選擇合適的點三水平進行，對于沒有制定最高殘留量（MRL） 的，應在LOD、常見限量指標選擇合適的點三水平進行。每個點的重復測定次數不得小于6次。測試結果通過實驗室內變異系數表達，標準偏差（S） 可用Bessel公式計算得到（CV=標準偏差/平均值）。

3.5 重復性限或復現性限

重復性限（r） 是指重復性條件下由同一操作者測定2次，2次測試結果的絕對差值不超過此數的概率為95%，再現性限（R）是指在不同的實驗室，由不同的操作者使用不同的設備，按相同的測試方法，對統一被測對象獨立進行測試，2次測試結果的絕對差值不超過此數的概率為95%。r和R均通過實驗室協作獲得，一般要求協作實驗室不少于8家。

4 結語

為確保檢測數據結果準確性、可靠性，方法確認和驗證是一項不容忽視的工作，結合實驗室實際情況做好確認和驗證工作，以得到準確的測量結果[4-5]。

參考文獻：

[1]全國認證認可標準化技術委員.ISO/IEC 99—2007：國際計量學詞匯基礎和通用概念及相關術語 [S].北京：中國標準出版社，2007.

[2]全國認證認可標準化技術委員會.GB/T 127025檢測和校準實驗室能力通用要求 [S].北京：中國標準出版社，2005.

[3]中國合格評定國家認可委員會.JJF1059.1—2012測量不確定度評定與表示 [S].北京：中國標準出版社，2007.

[4]胡朝暾，胡興，付明，等.生物化學實驗室的建設與管理 [J].農產品加工，2017（6）：79-81.

[5]許朝麗，石艷培.“食品分析”開放實驗室教學模式的探索與實踐 [J].農產品加工，2016（6）：87-88.◇