大鯢體表黏液透明質酸提取及其抗氧化活性的研究

于海慧，李 偉，佟長青

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連 116023）

0 引言

大鯢具有極高的經濟價值，隨著水生野生動物特許利用政策的出臺，養殖大鯢在我國各地得到普遍推廣，逐漸成為一種極具市場前景的新興養殖品種[1-2]。大鯢真皮內分布有大量的多細胞腺體，主要為黏液腺和顆粒腺，其中黏液腺遍布全身，可分泌出大量的濕滑黏液。陳德經等人[3]采用水提取、堿提取、酸提取和酶提取等方法，從大鯢黏液中提取出粗多糖，其單糖組分為甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖。葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖為透明質酸（Hyaluronic acid，HA）的組成單元。因此，大鯢皮膚及其黏液是透明質酸的潛在來源。不同來源的純的HA結構完全相同，僅在相對分子量大小上存在差異，具有良好的生物相容性，作為一種可吸收、可降解的生物材料，已在藥物、化妝品等領域有著廣泛的應用[4]。

自由基具有極強的氧化性，生物體生化反應常常會導致自由基的產生[5]，進而造成重要的生物大分子的損傷，使機體承擔患病風險[6]。關于透明質酸抗氧化作用的相關報道已有很多。例如，李密等人[7]從烏賊眼中提取出的HA-1和HA-2，在質量濃度為1～5 mg/mL時，隨著質量濃度的增加，其清除·OH和DPPH·的能力也增強。于樂惠等人[8]監測了關節腔內注射透明質酸鈉4周后患者關節液中超氧化物歧化酶（SOD） 和丙二醛（MDA） 含量的變化，發現SOD含量明顯上升，MDA含量明顯下降（p＜0.05或p＜0.01）。馮寧等人[9]研究了口服HA后血清SOD活性，發現HA具有體內抗氧化作用。

以往對大鯢的研究，主要集中在肉、皮的粗加工和酶解獲取活性肽等，而對從大鯢中提取HA及其抗氧化活性的研究報道較少。以大鯢體表黏液為原料，進行大鯢體表黏液中透明質酸提取工藝研究，同時對大鯢體表黏液透明質酸進行體外抗氧化評價，以期更好地利用大鯢資源，為大鯢深加工提供重要的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鯢黏液，張家界（中國）金馳大鯢生物科技有限公司提供；TSK-gel G4000 PWXL型色譜柱，日本TOSOH公司提供；2,2-二苯基-1-苦肼基自由基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH·） （AR）、2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-Azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid） diammonium salt，ABTS） （AR），美國 Sigma公司提供；DEAE-纖維素DE-52，北京索萊寶科技有限公司提供；胰蛋白酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；其他試劑為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鯢黏液預處理

冷凍保藏的大鯢黏液解凍后，加入生理鹽水（1∶2，m/V），勻漿后備用。

1.2.2 酶解提取透明質酸的方法

勻漿后的大鯢黏液，調節溶液pH值，加入蛋白酶酶解，酶解后于100℃條件下處理5 min。冷卻至室溫后，以轉速9 000 r/min離心15 min，上清液加入2倍體積95%的乙醇，于3℃條件下沉淀24 h。沉淀用0.1 mol/L NaCl溶解，調pH值至4.5，加入1/4體積氯仿/正丁醇（4∶1，V/V） 混合液除蛋白3次。上清液加入2倍體積的95%乙醇，于3℃條件下靜置12 h后離心，沉淀以蒸餾水溶解，冷凍干燥，得大鯢透明質酸粗提物。

1.2.3 DE-52分離透明質酸

以去離子水洗脫DEAE-纖維素DE-52柱（φ15×150）至平衡。將5.0 mg/mL的大鯢透明質酸粗提物溶液通過孔徑0.45μm針筒式無機膜過濾后，取2.0 mL濾液上樣，以1 mL/min去離子水洗脫，40管后，以0～1 mol/L NaCl進行梯度洗脫。以間羥基聯苯法[10]和苯酚-硫酸法分別檢測各接收管溶液中葡萄糖醛酸、總糖量，收集葡萄糖醛酸/總糖為35%～48%洗脫液，透析凍干，得到純化后的大鯢HA樣品。

1.2.4 HA得率的測定

HA得率（濕基）計算公式如下：

HA得率=葡萄糖醛酸質量/0.483 8/大鯢黏液質量×100%.

1.2.5 透明質酸性質

將干燥的HA樣品與KBr混勻后壓片，并通過Frontier FT-IR光譜儀（Perkin-Elmer） 測定樣品的FT-IR光譜。

HA樣品以D2O溶解，樣品質量濃度為20 mg/mL，于25～28℃，500 MHz條件下，在Varian Unity 500核磁共振譜儀上進行13CNMR檢測。

使用雙蒸水配制5 mg/mL分子量分別為10 000，70 000，500 000，2 000 000 Da的標準葡聚糖溶液和大鯢HA溶液，以孔徑0.45μm無機膜過濾后，使用TSK-gel G4000 PWXL色譜柱，通過高效液相色譜儀，以0.6 mL/min雙蒸水洗脫，以標準葡聚糖繪制標準曲線，并計算大鯢HA分子量。

1.2.6 抗氧化活性測定

DPPH·清除能力測定采用Cotelle N等人[11]的方法，·OH清除能力測定采用趙翾等人[12]的方法，ABTS+·清除能力測定采用Miller N等人[13]的方法，還原力測定采用Hinneburg I等人[14]的方法。

2 結果與分析

2.1 酶添加量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間對大鯢HA得率的影響

胰蛋白酶添加量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間對大鯢HA得率的影響見圖1。

圖1 胰蛋白酶添加量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間對大鯢HA得率的影響

由圖1（a）可知，隨著胰蛋白酶添加量的增加，HA得率也隨之增加，這是因為酶添加量的增加會增大其相互作用的接觸面積，也就使酶解速率加快。當酶添加量為2%時，HA得率達到最大值，但酶添加量繼續增加時HA得率反而減少。由圖1（b） 可知，隨酶解pH值的增加HA得率也逐漸增加，當pH值為8時HA得率最大，這是由于在pH值8時，胰蛋白酶處于一種解離狀態，最有利于與大鯢黏液中蛋白質的結合并發生催化作用，活力最高。隨著pH值繼續增加HA得率逐漸減少，可能是由于溶液堿性過大而破壞HA的穩定性。由圖1（c）可知，HA得率會隨著酶解溫度的升高而逐漸升高，這是由于溫度的升高可以增加反應速率，當酶解溫度為37℃，HA得率達到最大值，當溫度繼續增加時，HA得率逐漸下降。從圖1（d） 可以看出，隨著酶解時間的增加，HA得率出現先升高后降低的趨勢，在3 h時，HA得率為最大值。這可能是由于時間過長，使透明質酸被降解。

2.2 最佳提取工藝的優化

根據單因素試驗的結果，在pH值8.0時，考查酶解時間、酶解溫度、酶添加量3個因素對HA得率的影響，并在單因素試驗的基礎上設計L9（34）正交試驗。

正交試驗結果見表1，顯著性檢驗見表2。

表1 正交試驗結果

表2 顯著性檢驗

極差分析結果表明，正交試驗中最佳因素組合為A3B2C1，即酶解時間4 h，酶解溫度37℃，酶添加量1.5%。顯著性檢驗結果表明，酶添加量對于大鯢HA得率影響小，作為誤差項，而酶解溫度和酶解時間影響較大，但不顯著。

2.3 大鯢透明質酸粗提物純化

大鯢黏液透明質酸DE-52陰離子交換層析見圖2。

圖2 大鯢黏液透明質酸DE-52陰離子交換層析

由圖2可以看出，在以0～1 mol/L NaCl進行洗脫時，總糖曲線有2個主要峰。這2個峰的葡萄糖醛酸占總糖分別為44.76%和12.94%。100 mg透明質酸完全水解，可以得到48.38 mg葡萄糖醛酸，因此，粗大鯢透明質酸經DE-52分離后，收集梯度洗脫第1個峰，經透析凍干后，得到的透明質酸相對較純。

2.4 大鯢HA性質

大鯢HA的FT-IR見圖3。

圖3 大鯢HA的FT-IR

由圖3可以看出，在波數3 400～3 230 cm-1有較強的吸收峰，峰值處于3 319 cm-1，為醇羥基的O-H伸縮振動特征峰，在1 171 cm-1處的吸收峰為醇羥基的C-OH伸縮振動特征峰，在波數3 570～3 050 cm-1出現了寬的吸收帶，表明存在多個O-H伸縮振動吸收峰的疊加，表明存在多個醇羥基；在波數1 420～1 390 cm-1的吸收峰峰值處于1 396 cm-1，為羧基的對稱伸縮峰；在波數1 560～1 530 cm-1處有強吸收峰，主要為仲酰胺R1-NH-CO-R2中NH面內變角振動；在波數1 239 cm-1的吸收峰為仲酰胺R1-NH-CO-R2的特征吸收峰，即酰胺III吸收帶，為C-N伸縮振動特征峰，表明存在仲酰胺基團。與標準物質透明質酸鈉相比，大鯢HA各基團出峰位置基本一致，這與陰離子柱DE-52結果（即葡萄糖醛酸占總糖44.76%）一致，也說明了所提取到的為較純的大鯢透明質酸。

大鯢HA13C-NMR見圖4。

圖4 大鯢HA13C-NMR

δ100.2×10-6為異頭碳信號，δ55.34×10-6為C2信號，δ84.75×10-6為C3信號，δ70.29×10-6為C4信號，δ76.41×10-6為C5信號，δ61.34×10-6為 C6信號，δ174.83×10-6反映 C=O信號，δ24.99 ppm為CH3信號[15]。

通過HPLC，以保留時間為橫坐標，以標準葡聚糖分子量的對數為縱坐標，得標準曲線Y=-0.244 1X+8.700 9（R2=0.997），進而得出大鯢HA分子量為4.85×106Da。

2.5 抗氧化活性

大鯢透明質酸清除DPPH·能力見圖5。

圖5 大鯢透明質酸清除DPPH·能力

由圖5可以看出，大鯢HA清除DPPH·，·OH，ABTS+·和還原Fe3+能力具有濃度依賴性，即隨著HA質量濃度的增加而增強，其清除自由基IC50分別為8.13，12.10，7.00 mg/mL。Sadhasivam G 等人[16]發現海洋黃貂魚（Aetobatus narinari）肝臟中分離的HA具有清除DPPH·的能力。Kanchana等人發現Amussium pleuronectus（Linnaeus，1758） 也具有清除DPPH·的能力。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗確定了從大鯢黏液中提取透明質酸的最佳工藝條件為使用胰蛋白酶，酶添加量1.5%，pH值8.0，酶解溫度37℃，酶解時間4 h。在該工藝條件下，HA得率為1.704 1 mg/g，分子量約為4.85×106Da。紅外光譜分析表明大鯢HA與透明質酸鈉標準品的出峰位置基本一致。13C-NMR譜表明大鯢透明質酸含有異頭碳。大鯢黏液透明質酸具有一定的體外抗氧化活性，能夠清除DPPH·，·OH，ABTS+·和還原 Fe3+。

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