17例病毒性肺炎老年患者的臨床特點(diǎn)及甲型H1N1流感病毒分子特征

葛以躍 譚焰 陳晨 吳濤 朱小娟 趙康辰 王麗 谷偉 崔侖標(biāo)

210009南京,衛(wèi)生部腸道病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省疾病預(yù)防控制中心(葛以躍、吳濤、朱小娟、趙康辰、崔侖標(biāo))；210006南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院呼吸科(譚焰、陳晨、王麗、谷偉)

流感病毒分為甲、乙、丙3種類型,其中甲型流感病毒的宿主最為廣泛,其抗原變異率也最高,容易引起大流行。2009年初,一種新型甲型H1N1流感病毒(pandemic H1N1/09 virus)首先在墨西哥發(fā)現(xiàn),而后在全球不斷蔓延[1],目前已成為季節(jié)性流感病毒的一部分,嚴(yán)重威脅著人類健康[2]。

老年人的各個(gè)器官生理功能逐步下降,如同時(shí)伴有慢性基礎(chǔ)性疾病,則更容易感染流感病毒,而且很容易發(fā)展為肺炎.研究表明,肺炎是流感患者病情加重和死亡的重要原因[3]。國(guó)家流感中心流感監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,自2017年底至2018年初,我國(guó)流感發(fā)病率較往年同期明顯升高,以甲型H1N1流感和乙型流感的流行為主,伴隨著部分甲型H3N2流感的流行。與往年相比,乙型流感病毒的Yamagata型顯著增多,使得現(xiàn)有三價(jià)疫苗對(duì)該病毒亞型失去預(yù)防作用。對(duì)于此次流行的甲型H1N1流感病毒,尚未見(jiàn)病原學(xué)特征顯著改變的相關(guān)報(bào)道,進(jìn)一步研究其病原分子特征對(duì)于疾病的預(yù)防和診治具有重要意義。本研究對(duì)南京市第一醫(yī)院呼吸科2018年1～3月份收治的,確診為甲型H1N1流感病毒性肺炎的老年患者的臨床資料和流感病毒病原學(xué)進(jìn)行分析,探討老年人甲型H1N1流感病毒性肺炎的臨床特點(diǎn)及本流行季的病毒分子特征,為老年流感的防治提供依據(jù),提高臨床診治效果。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象在2018年1～3月份期間,收集在南京市第一醫(yī)院呼吸科住院的有流感樣癥狀的老年(≥60歲)肺炎患者40例,最終確診為甲型H1N1流感病毒感染者共17例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)出現(xiàn)過(guò)流感樣癥狀；(2)病程中經(jīng)胸部CT或胸片檢查證實(shí)肺炎存在；(3)患者痰標(biāo)本或鼻咽拭子標(biāo)本甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性。病例的臨床資料采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)采集表進(jìn)行收集。本研究獲得南京第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò),標(biāo)本采集獲得患者或家屬知情同意。

1.2 儀器與試劑全自動(dòng)核酸提取儀及其配套試劑(EX-DNA/RNA病毒)購(gòu)自西安天隆科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7900HT)購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；PrimeScrip RT reagent Kit(Perfect Real Time)、PrimeScript Reverse Transcriptase和 LA Taq購(gòu)自日本 TaKaRa公司；Nextera XT Library Preparation Kit和MiSeq Reagent Kit v3(600 cycles)購(gòu)自美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與病毒核酸檢測(cè)：采集目標(biāo)患者的痰標(biāo)本或鼻咽拭子標(biāo)本,-80℃冰箱保存。參照全自動(dòng)核酸提取儀和病毒核酸提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取病毒總核酸。采用One Step PrimeScrip RTPCR Kit通過(guò)Real-time RT-PCR法[4-5]檢測(cè)甲型流感病毒及其亞型(季節(jié)性H3N2和甲型H1N1流感病毒)。同時(shí)采用Real-time PCR/RT-PCR法對(duì)每一份樣本的28種常見(jiàn)呼吸道病原進(jìn)行檢測(cè),觀察是否存在合并感染。

1.3.2 病毒全基因組擴(kuò)增和高通量測(cè)序：采用Primescript Reverse Transcriptase和甲型流感病毒8節(jié)段通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),制備的cDNA進(jìn)一步采用LA Taq和一對(duì)甲型流感病毒通用引物擴(kuò)增流感病毒全基因組,純化并回收PCR產(chǎn)物。采用Qubit 2.0熒光劑對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量,而后作為模板制備測(cè)序文庫(kù),具體操作按Nextera XT Library Preparation Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將制備好的文庫(kù)加入MiSeq測(cè)序樣品孔,按2×300 bp進(jìn)行末端配對(duì)測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析測(cè)序產(chǎn)生的fastq原始數(shù)據(jù)采用生物信息學(xué)綜合分析工具CLC Genomic Workbench 7.5.1進(jìn)行處理和分析。從全球流感共享數(shù)據(jù)庫(kù)(GISAID)下載甲型H1N1流感病毒參考序列,采用MEGA 6.0軟件對(duì)病毒進(jìn)化進(jìn)行分析,通過(guò)鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),重復(fù)抽樣1 000次(Bootstrap=1 000)對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)通過(guò)對(duì)氨基酸序列比對(duì)進(jìn)一步分析病毒的抗原位點(diǎn)、毒力位點(diǎn)和耐藥位點(diǎn)的變異情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料采用±s表示,計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比來(lái)表示,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的一般資料在有流感樣癥狀的40例老年(≥60歲)肺炎患者中,通過(guò)病毒核酸檢測(cè),最終確診為甲型H1N1流感病毒感染的共有17例。如表1所示：在17例甲型H1N1流感患者中,7例存在合并感染,比例達(dá)41.2%,其中合并單純皰疹病毒感染2例,合并鼻病毒、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和EB病毒感染的各1例。患者平均年齡為73.8±10.8歲,9例≥75歲(52.9%),其中男性占總例數(shù)的57.9%。重癥與危重癥病例的比例為0.89∶1。所有患者至少合并1種基礎(chǔ)性疾病,慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)、高血壓和腦血管病是最為常見(jiàn)的基礎(chǔ)病,合并比例分別為52.9%、52.9%和35.3%。存在1種以上基礎(chǔ)病的患者比例達(dá)70.1%,存在重要基礎(chǔ)性疾病(冠心病、充血性心力衰竭、慢性腎功能不全、惡性腫瘤、肝硬化和免疫抑制)的比例為41.2%。在本組老年人群中,流感疫苗的接種率為0%。

表1 患者一般資料和基礎(chǔ)性疾病合并情況Tab.1 General information and the existence of underlying diseases of the patients

2.2 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查在甲型H1N1流感病毒性肺炎的老年患者中,呼吸系統(tǒng)癥狀和發(fā)熱是最為主要的臨床表現(xiàn)。88.2%的患者存在發(fā)熱,最高體溫為38.38±0.84℃,其中高熱(≥39℃)患者所占比例為41.2%。咳嗽、咽痛、呼吸困難的比例分別為100%、11.8%和76.5%。23.5%的患者同時(shí)伴有消化道癥狀。患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)為(6.25±2.77)×109/L,以正常和降低為主。47.1%的患者伴有低鈉血癥,其中2例(11.8%)屬于重度(＜125 mmol/L)。部分患者伴有肝功能異常,谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素異常的比例分別為11.8%、17.6%和11.8%。94.1%的患者均伴有乳酸脫氫酶的增高。胸部影像表現(xiàn)為雙肺病變的比例為76.5%,其中危重癥患者雙肺病變的比例高于重癥患者,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 氨基酸位點(diǎn)分析

2.3.1 抗原位點(diǎn)和宿主特異性位點(diǎn)：與疫苗株相比,所測(cè)毒株HA蛋白10處氨基酸變異中有9處發(fā)生在HA1上,其中3處發(fā)生在抗原位點(diǎn)上(Ca、Cb和Sa各1個(gè)),分別為H138Y、S74R和S164T,具體變異情況見(jiàn)表3。受體結(jié)合位點(diǎn)(Receptor-binding site,RBS)是流感病毒宿主特異性的一個(gè)重要決定因素,本研究所有毒株的HA蛋白未發(fā)生RBS的氨基酸變異。除了RBS外,PB2中的一些位點(diǎn)在宿主特異性中也發(fā)揮重要作用,通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),所測(cè)毒株P(guān)B2蛋白的宿主特異性位點(diǎn)均與疫苗株相同,為590S、591R、627E、701D 和714S。

2.3.2 潛在糖基化位點(diǎn)：疫苗株A/Michigan/45/2015的HA蛋白有9個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(10NNST、11NST、23NVT、87NGT、162NQS、276NTT、287NTS、481NGT和540NGS),除了A/Nanjing/2018031/2018的潛在糖基化位點(diǎn)與疫苗株完全相同外,其余8株病毒HA蛋白的162位均為162NQT,但同樣為N-糖基化位點(diǎn)的保守序列模式,所以未發(fā)生潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量上的增減。

2.3.3 毒力位點(diǎn)和耐藥位點(diǎn)：與疫苗株相同,所有毒株的HA裂解位點(diǎn)均為為PSIQSR↓GLFGA,只含有一個(gè)堿性氨基酸,為非高致病力特征。除了HA裂解位點(diǎn)外,流感病毒的毒力位點(diǎn)分布于多個(gè)節(jié)段上。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn),所測(cè)毒株的相關(guān)毒力位點(diǎn)特征為：222D(HA,H1 numbering)、139T(M1)、215 A(M1)、42S(NS1)、92D(NS1)、36 A(PA)、353 K(PA)、99H(PB1)、368I(PB1)、89 V(PB2)和 357H(PB2),與疫苗株保持一致,未發(fā)生毒力改變。在耐藥方面,A/Nanjing/2018029/2018毒株的NA發(fā)生了H275Y(N1 numbering)變異,提示可能對(duì)流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物耐藥。

表2 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查Tab.2 Clinical features and laboratory examination of the influenza A(H1N1)viral pneumonia in the elderly

表3 甲型H1N1病毒HA蛋白氨基酸位點(diǎn)變異情況Tab.3 Variation of HA amino acid sites of the influenza A(H1N1)viruses

2.4 甲型H1N1流感病毒HA基因進(jìn)化分析在17例甲型H1N1流感標(biāo)本中,共有9例測(cè)序獲得了病毒全基因組序列,所有毒株的8個(gè)基因節(jié)段平均測(cè)序深度為140×～47098×。HA基因進(jìn)化分析結(jié)果表明,與疫苗株A/Michigan/45/2015相似,本研究所有毒株的HA基因均屬于甲型H1N1病毒6B組6B.1亞組,以S84 N、S162 N和I216T氨基酸替換為特征。此外,本研究所有毒株還發(fā)生了S74R和I295 V氨基酸變異。除了A/Nanjing/2018031/2018之外,所有毒株還發(fā)生了S164T變異。各毒株之間的HA核苷酸同源性為98.1% ～100%,氨基酸同源性為97.7%～100%。所測(cè)毒株HA核苷酸與疫苗株的同源性為97.8% ～98.9%,氨基酸同源性為97.5%～99.6%。HA基因進(jìn)化分析情況詳見(jiàn)圖1。

注：▲本次測(cè)序毒株；●WHO推薦疫苗株圖1 甲型H1N1流感病毒HA基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Note： ▲Strains sequenced in this study；●WHO recommended vaccine strainsFig.1 Phylogenetic tree of the HA gene of influenza A(H1N1)viruses

3 討論

流感病毒是引起老年肺炎的主要病毒之一,研究表明,對(duì)于甲型H1N1流感而言,老年病例的病死率顯著高于其他年齡段[6]。因此,了解老年甲型H1N1流感病毒性肺炎的臨床特點(diǎn),進(jìn)一步分析其在南京地區(qū)老年人中的分子特征,對(duì)于臨床診斷、疾病預(yù)防、針對(duì)性用藥以及避免濫用抗生素均具有重要意義。

劉曉偉等[7]分析了86例以青壯年為主的甲型H1Nl流感病毒性肺炎患者的臨床資料,只有15.1%的患者存在基礎(chǔ)疾病。本研究發(fā)現(xiàn),所有入選的老年患者至少合并有1種基礎(chǔ)性疾病,存在1種或以上嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病的患者比例達(dá)41.2%。高齡和基礎(chǔ)病的存在直接影響到甲型流感的嚴(yán)重程度和預(yù)后,增加了臨床治療的難度[8]。《中國(guó)慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》指出,使用流感疫苗可以減少COPD患者的嚴(yán)重程度和死亡率,說(shuō)明COPD患者很容易發(fā)生流感感染并導(dǎo)致死亡,在本研究中,老年流感肺炎患者的COPD合并比例高達(dá)52.9%,然而流感疫苗的接種率卻為0%,所以,老年COPD患者更應(yīng)該定期接種流感疫苗以預(yù)防感染。通過(guò)對(duì)臨床表現(xiàn)分析發(fā)現(xiàn),發(fā)熱和呼吸系統(tǒng)癥狀最為突出,與已有報(bào)道一致[8]。23.5%的患者伴有消化道癥狀,低于美國(guó)所報(bào)道的比例[9],但高于國(guó)內(nèi)報(bào)道的比例[10]。在實(shí)驗(yàn)室檢查方面,超過(guò)90%的患者出現(xiàn)乳酸脫氫酶增高,可能與肺臟和心肌的損害有關(guān)。胸部影像表現(xiàn)以雙肺病變?yōu)橹?與以往報(bào)道一致[11],危重癥患者雙肺病變的比例高于重癥患者,然而差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究的樣本量較小,部分結(jié)論還需要進(jìn)行大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。

二代測(cè)序技術(shù)在流感病毒的鑒定及全基因組序列分析方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[12],與WHO推薦疫苗株A/Michigan/45/2015相同,本研究所測(cè)病毒的HA基因均屬于甲型H1N1病毒的6B組6B.1亞組。抗原位點(diǎn)的變異直接影響到流感病毒的抗原漂移,與疫苗株相比,本研究所測(cè)病毒的HA蛋白發(fā)生了10處氨基酸變異,有3處發(fā)生在抗原位點(diǎn)上,分別為Ca抗原的H138Y變異、Cb抗原的S74R變異和Sa抗原的S164T變異,這些變異是否會(huì)影響到疫苗株的保護(hù)效果還有待進(jìn)一步研究。糖基化位點(diǎn)的主要作用是穩(wěn)定HA結(jié)構(gòu),防止HA水解的同時(shí)還可以阻礙抗體的識(shí)別,本研究中雖然大部分病毒發(fā)生了162NQS到162NQT的改變,但糖基化位點(diǎn)的數(shù)量并未發(fā)生增減。由于甲型H1N1病毒對(duì)烷胺類抗病毒藥物普遍耐藥,所以病毒是否發(fā)生對(duì)NA抑制劑的耐藥尤為重要,A/Nanjing/2018029/2018毒株發(fā)生了H275Y變異,提示可能對(duì)流感病毒NA抑制劑類藥物耐藥從而影響治療效果,臨床資料顯示,在治療過(guò)程中,該患者的最高體溫達(dá)40度,在所有患者中最高,乳酸脫氫酶的水平達(dá)1 000 U/L,C反應(yīng)蛋白達(dá)122 mg/L,而且發(fā)生了呼吸衰竭,為危重癥病例,推測(cè)可能與NA抑制劑的治療效果不佳有一定關(guān)系。

雖然目前甲型H1N1流感未發(fā)生再次大流行,但是對(duì)于老年人特別是未接種流感疫苗者,很容易發(fā)生流感并發(fā)展為肺炎,預(yù)后較差。老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者多合并基礎(chǔ)疾病,容易產(chǎn)生合并感染,臨床工作者在診治過(guò)程中需要密切關(guān)注這些特點(diǎn)。隨著群體免疫壓力和抗病毒藥物壓力的選擇,甲型H1N1病毒可能在今后出現(xiàn)新的變異導(dǎo)致其抗原性和耐藥性發(fā)生變化,需要對(duì)病毒的分子特征持續(xù)監(jiān)測(cè),為疾病預(yù)防和臨床抗病毒治療提供依據(jù)。

利益沖突無(wú)