蝦青素保護PC-3細胞免受H2O2氧化應激的作用機制

倪曉鋒，于海寧，王姍姍，張程程，沈生榮,*

蝦青素是天然存在的類胡蘿卜素，但不同于其他類胡蘿卜素，其化學結構兩端每個芳香環上各有一個羥基和不飽和羰基，使其具有顯著的抗氧化能力，其抗氧化能力比β-胡蘿卜素高10 倍以上，是VE的500 倍以上，是天然的“超級抗氧化劑”。蝦青素廣泛存在于自然界，如大多數甲殼類動物和鮭科魚類體內，植物的葉、花、果，以及火烈鳥的羽毛中等。近年來，圍繞蝦青素的研究也逐漸展開，例如抗氧化、改善動脈粥樣硬化、抗炎癥和抗腫瘤等生物活性[1-7]。氧化應激涉及許多疾病的發病機理，包括癌癥，其最主要的標志物是活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS與細胞的增殖和凋亡密切相關[8-9]。現已證實，核因子E2相關基因2-血紅素氧合酶1（nuclear factor erythroid-2-related factor 2-heme oxygenase 1，Nrf2-HO-1）通路是抗氧化應激最重要的細胞保護機制之一。在氧化應激狀態下，機體Nrf2激活，轉入細胞核內與AU富含元件（AU-rich element，ARE）的基因序列結合，上調依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ：醌氧化還原酶（NADPH: quinoneoxido-reductase，NQO1）、HO-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）等的表達，從而發揮自身抗氧化應激的作用[10-12]。

本實驗采用H2O2誘導PC-3細胞氧化應激，通過觀察細胞存活率、細胞凋亡、ROS水平以及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）-Nrf2-HO-1通路，探討蝦青素對ROS所致細胞氧化損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PC-3細胞株 中國科學院細胞庫；蝦青素標準品、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；ROS、Annexin V-FITC試劑盒、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抑制劑（LY294002）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）抑制劑（U0126）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制劑（SP600125）、p38蛋白抑制劑（SB203580）碧云天生物技術研究所；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、吐溫20 北京索萊寶科技有限公司；B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、活化半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）、ERK、JNK、p38蛋白、Akt 美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設備

MD29 SpectraMax酶標儀 芬蘭Thermal Lab System公司；FC500MCL流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司；Cary Eclipase熒光分光光度計 美國Virian公司；WD-9405A脫色搖床、DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 不同濃度H2O2對PC-3細胞的氧化損傷作用

細胞以1×105個/mL密度接種到96 孔板中，每孔200 μL，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養12 h后，用0、50、100、200、400、800 μmol/L H2O2處理24 h。棄培養液，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜，在490 nm波長處檢測吸光度。篩選出適宜濃度的H2O2氧化損傷模型。

1.3.2 蝦青素對H2O2誘導PC-3細胞損傷模型的細胞存活率影響

將PC-3細胞接種到96 孔板中，每孔200 μL，培養12 h，然后設置5 個組，分別是正常對照組（只含培養液，CK）、蝦青素處理組（蝦青素濃度分別為0、5、10、20 μmol/L）。蝦青素處理組加入相應濃度的蝦青素，處理24 h后，加入400 μmol/L H2O2，繼續培養24 h后，MTT法檢測在490 nm波長處的吸光度。

1.3.3 蝦青素對H2O2誘導的PC-3細胞損傷模型的ROS水平的影響

將處于對數生長期的PC-3細胞接種于6 孔板中，細胞密度分別為1×105個/mL，每孔接種2 mL，培養12 h后，棄培養液，用蝦青素（0、5、10、20 μmol/L）處理細胞24 h，并設CK組，每組設置3 個平行，除CK組外，其余各組加入400 μmol/L H2O2，繼續培養24 h后，胰酶消化收集細胞，所有組經磷酸鹽緩沖液清洗一遍后，加入1 mL 10 μmol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），細胞濃度一般為1×106～2×107個/mL，37 ℃細胞培養箱內孵育25 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。離心后去除上清液，用無血清細胞培養液洗滌離心細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，最后重懸于無血清培養基，立即用流式細胞儀檢測熒光強度（488 nm激發波長，525 nm發射波長）。

1.3.4 蝦青素對H2O2誘導的PC-3細胞損傷模型的細胞凋亡的影響

細胞培養及分組處理過程同1.3.3節。培養結束后，將細胞培養液吸出至離心管，磷酸鹽緩沖液洗滌貼壁細胞1 次，轉入上述離心管，胰酶消化后加入上述離心管收集的培養液（此步驟的目的一方面是收集已經懸浮的凋亡或壞死細胞，另一方面培養液中的血清可以中和胰酶，終止消化過程）。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，用磷酸鹽清洗2 遍后重懸并計數。取5×104～1×105個重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結合液并重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，加入10 μL碘化丙啶，室溫避光孵育10～20 min后進行流式細胞儀檢測。

1.3.5 蝦青素對H2O2誘導的PC-3細胞損傷模型中Bcl-2/Bax、caspase-3表達的影響

細胞培養同1.3.3節，培養12 h后，棄培養液，用蝦青素（20 μmol/L）、H2O2（400 μmol/L）、蝦青素+H2O2（20 μmol/L蝦青素+400 μmol/L H2O2）處理細胞24 h，并設CK組，每組設置3 個平行，胰酶消化收集細胞。Western blotting法測定表達情況。

1.3.6 蝦青素對H2O2誘導的PC-3細胞損傷模型中MAPK通路的影響

細胞培養和分組同1.3.5節。Western blotting法測定表達情況。

1.3.7 蝦青素對H2O2誘導的PC-3細胞損傷模型中Nrf2-HO-1通路的影響

細胞培養同1.3.3節，培養12 h后，棄培養液，用蝦青素（0、5、10、20 μmol/L）處理細胞24 h，每組設置3 個平行，胰酶消化收集細胞。Western blotting法測定表達情況。

1.3.8 通路抑制劑對蝦青素影響H2O2誘導的PC-3細胞損傷模型中Nuclear Nrf2表達的影響

細胞培養同1.3.3節，培養12 h后，棄培養液，用ERK抑制劑（U0126）、Akt抑制劑（LY294002）預處理PC-3細胞1 h，而后再用20 μmol/L蝦青素處理24 h，另設CK組和20 μmol/L蝦青素組，每組設置3 個平行，胰酶消化收集細胞。Western blotting法測定表達情況。

1.3.9 通路抑制劑對蝦青素影響H2O2誘導的PC-3細胞損傷模型中細胞存活率的影響

細胞培養同1.3.3節，培養12 h后，棄培養液，設立H2O2處理組和無H2O2處理組，無H2O2處理組用ERK、JNK抑制劑和p38蛋白抑制劑預處理PC-3細胞1 h，而后再用20 μmol/L蝦青素處理48 h；H2O2處理組用U0126、SP600125和SB203580預處理PC-3細胞1 h，而后再用20 μmol/L蝦青素處理24 h后，加入400 μmol/L H2O2，繼續培養24 h。設立CK組，每組設置3 個平行，胰酶消化收集細胞。Western blotting法測定表達情況。

1.3.10 Western blotting分析

細胞收集后提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白質量濃度，于-80 ℃保存。樣品蛋白變性后，取50 μg蛋白樣品用于SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，采用質量分數為12%的分離膠、質量分數為5%的濃縮膠分離蛋白，300 mA恒流轉移0.5 h至聚偏二氟乙烯膜，用質量分數5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育，4 ℃反應過夜，吐溫20-Tris緩沖液（Tris-buffered saline tween 20，TBST）搖床洗3 次后用二抗室溫孵育30 min，電化學發光（electro-chemi-luminescence，ECL）顯影，將膠片掃描存檔，分析光密度值。

1.4 數據統計分析

所有實驗結果以 ±s表示，用SPSS 22.0分析軟件進行數據統計分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 H2O2對PC-3細胞的氧化損傷作用

PC-3細胞經H2O2處理后，細胞存活率明顯下降，與濃度成負相關，即濃度越大，存活率越低（圖1）。H2O2濃度200、400、800 μmol/L的細胞存活率分別為77.5%、56.3%和34.6%，與CK組比較有統計學差異（P＜0.05）。綜合考慮，后續實驗用400 μmol/L H2O2誘導氧化損傷模型。

圖1 H2O2對PC-3細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of H2O2 on cell viability of PC-3 cells

2.2 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞存活率的影響

圖2 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞存活率的影響Fig. 2 Effect of astaxanthin on cell viability of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

如圖2顯示，無蝦青素處理組經H2O2氧化損傷處理后，細胞存活率顯著下降（P＜0.01）。用5、10、20 μmol/L蝦青素預處理后再經H2O2氧化損傷，PC-3細胞存活率分別提高到58.3%、65.3%和82%。與無蝦青素處理組相比較，20 μmol/L蝦青素組具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞ROS水平的影響

圖3 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞ROS水平的影響Fig. 3 Effect of astaxanthin on ROS level of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

H2O2誘導的細胞損傷與ROS的積累密切相關。DCFH-DA探針進入細胞后能與細胞內部存在的過氧化物、氫過氧化物等氧化分解，產生2’,7’-二氯熒光素（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein，DCF），而DCF具有熒光，因此通過測定熒光強度，就能得出ROS的水平。由圖3可知，400 μmol/L H2O2處理后，與CK組相比，PC-3細胞中熒光強度顯著增強（P＜0.01）。蝦青素預處理組可以降低H2O2處理所致細胞內升高的ROS水平，且與蝦青素劑量呈現負相關，即蝦青素濃度越高，細胞內ROS水平越低。20 μmol/L蝦青素預處理后，細胞內ROS水平與CK組相比無顯著性差異，結果表明，蝦青素可以抑制或清除H2O2誘導的ROS的產生。

2.4 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞凋亡的影響

圖4 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞凋亡率的影響Fig. 4 Effect of astaxanthin on cell apoptosis of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

表1 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞凋亡中B1、B2、B3、B4區所占比例變化Table 1 Percentage changes of B1, B2, B3 and B4 area in apoptosis of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2 after astaxanthin treatment

細胞經Annexin V-FITC和PI染色后可通過流式細胞儀將細胞區別為死亡細胞（B1）、晚期凋亡細胞（B2）、正常細胞（B3）和早期凋亡細胞（B4）。如圖4和表1，PC-3細胞經H2O2氧化損傷后，細胞凋亡率快速上升，無蝦青素處理組細胞凋亡率為51.4%，明顯高于CK組。不同濃度蝦青素處理后，PC-3細胞的凋亡率分別下降到39.8%、29.5%和14.8%，濃度越大，凋亡率越小。實驗結果表明H2O2可以導致PC-3細胞快速凋亡，蝦青素處理可以降低其細胞凋亡率。

2.5 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞中Bcl-2/Bax表達水平和caspase-3激活的影響

圖5 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of astaxanthin on Bcl-2 and Bax family protein expression in PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

在細胞凋亡的過程中，凋亡負調控蛋白Bcl-2和凋亡正調控蛋白Bax的調控是凋亡的關鍵因素，尤其是Bcl-2/Bax比率是啟動細胞凋亡的“分子開關”。因此，分析了蝦青素對H2O2誘導氧化應激引起的Bcl-2/Bax比率變化的影響。如圖5A所示，H2O2處理組引起Bcl-2蛋白表達的下降，同時增加了Bax蛋白的表達，導致Bcl-2/Bax比率降低（圖5B）。蝦青素處理能夠抑制H2O2引起的Bcl-2/Bax比率下降。

圖6 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞cleaved caspase-3蛋白表達的影響Fig. 6 Effect of astaxanthin on cleaved caspase-3 protein expression in PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

caspase-3的激活會導致細胞凋亡的發生。如圖6所示，H2O2處理24 h后，cleaved caspase-3的表達明顯上升，而蝦青素+H2O2處理的細胞中，cleaved caspase-3的表達下降，表明蝦青素能抑制H2O2引起的caspase-3的激活。

2.6 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞MAPK通路的影響

圖7 蝦青素對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞ERK、JNK、p38通路的影響Fig. 7 Effect of astaxanthin on ERK, JNK and p38 signaling pathways in PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

MAPK家族的激活參與氧化應激誘導的細胞死亡，目前已經發現JNK和p38的激活介導H2O2誘導的細胞凋亡過程[13]。如圖7B1、B2、C1、C2所示，PC-3細胞經H2O2誘導后，p-JNK和p-p38顯著上升（P＜0.01），表明JNK和p38途徑被激活，細胞凋亡上升，而蝦青素+H2O2處理可以抑制H2O2引起的JNK和p38的磷酸化，降低細胞凋亡的產生。ERK是一種多功能蛋白激酶，其激活水平決定了細胞存活與否。H2O2誘導的PC-3細胞中，ERK通路相比CK組被抑制，細胞凋亡顯著上升（P＜0.05），而蝦青素+H2O2處理組，ERK水平顯著上升，與H2O2組相比，差異顯著（P＜0.05）（圖7A1、A2）。

2.7 蝦青素對Nrf2和HO-1表達的影響

圖8 蝦青素對PC-3細胞Nrf2、HO-1表達的影響Fig. 8 Effect of astaxanthin on Nrf2 and HO-1 expression in PC-3 cells

Nrf2是調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子，當氧化應激發生后，Nrf2從細胞質轉入細胞核，轉入細胞核后，與抗氧化元件ARE相結合，啟動ARE調節的Ⅱ相酶的表達。如圖8A1、A2所示，正常情況下，PC-3細胞中Nrf2磷酸化水平較低，當蝦青素作用后，顯著促進Nrf2的表達（P＜0.05），并呈濃度依賴性。HO-1在保護細胞免受氧化應激中發揮著非常重要的作用。因此研究了不同濃度蝦青素對PC-3細胞中HO-1的影響，結果表明蝦青素能夠促進HO-1的表達，促進效果與濃度呈正相關（圖8B1、B2）。

2.8 蝦青素對ERK和PI3K/Akt的影響

圖9 蝦青素對PC-3細胞ERK和Akt通路的影響Fig. 9 Effect of astaxanthin on ERK and Akt signaling pathways of PC-3 cells

圖10 ERK和Akt通路抑制劑對PC-3細胞核內Nrf2表達的影響Fig. 10 Effect of U0126 and LY294002 on nuclear Nrf2 expression in PC-3 cells

ERK和Akt的激活是參與細胞抗氧化應激的主要激酶，因此研究了它們的激活水平對Nrf2激活及HO-1表達的影響。如圖9A所示，不同濃度的蝦青素處理引起p-ERK和p-Akt水平的明顯上升，表明蝦青素可以激活ERK和PI3K/Akt通路，并呈濃度依賴性。進而通過ERK抑制劑和Akt抑制劑預處理PC-3細胞1 h，而后再用20 μmol/L蝦青素處理24 h。由圖10可知，CK組細胞核內Nrf2表達量較低，蝦青素處理能夠迅速升高Nrf2在細胞核內的表達，當ERK和PI3K/Akt通路被抑制后，細胞核內Nrf2的表達顯著降低（P＜0.01）。結果表明，蝦青素通過ERK和PI3K/Akt激活Nrf2，進而上調HO-1的表達。

2.9 蝦青素對ERK通路抑制H2O2介導的細胞毒性的影響

圖11 U0126、SP600125和SB203580對H2O2誘導氧化應激的PC-3細胞存活率的影響Fig. 11 Effect of U0126, SP600125 and SB203580 on cell viability of PC-3 cells with oxidative stress induced by H2O2

為了闡明MAPK通路在H2O2介導的細胞毒性損傷中的作用，研究了ERK抑制劑（U0126）、JNK抑制劑（SP600125）和p38蛋白抑制劑（SB203580）對H2O2誘導的細胞存活率的影響。如圖11所示，H2O2處理引起細胞存活率的顯著下降（P＜0.01），蝦青素的預處理可以顯著提高其存活率（P＜0.05）。當SP600125和SB203580預處理1 h后，并沒有影響蝦青素對PC-3細胞的保護作用，而用ERK抑制劑預處理1 h后再經蝦青素處理后，細胞的存活率顯著下降（P＜0.01），并低于H2O2對照組，表明ERK通路參與了蝦青素抑制H2O2介導的細胞毒性。

3 討 論

機體內ROS水平與抗氧化防御系統之間的平衡被打破后往往會引起氧化應激，其產生的ROS超過了內源性抗氧化酶系統的抗氧化能力，進而引起脂質過氧化、蛋白和DNA氧化狀態異常、細胞凋亡等問題[14]。很多研究表明，蝦青素處理能夠保護細胞免受氧化應激損傷[15-17]，提高細胞內抗氧化酶系統[18-19]，而蝦青素對前列腺癌細胞的影響及其通路相關的研究依然較少。研究發現，蝦青素處理能夠提高氧化應激的PC-3細胞存活率，并通過提高Bcl-2/Bax比率及抑制caspase-3的激活來降低細胞凋亡率，同時能夠顯著降低細胞內ROS水平。

正常情況下，PC-3細胞中Nrf2磷酸化水平較低[20-21]，當蝦青素作用后，顯著促進Nrf2的表達，并呈濃度依賴性，同時蝦青素能促進HO-1的表達，與濃度呈正相關。研究表明[22]，Nrf2/ARE通路的激活能夠啟動和誘導Ⅱ相酶的表達，如HO-1、NQO1等，這些酶能夠保護機體免受ROS的侵害[23-25]，從而增強細胞對抗氧化應激的能力，達到降低氧化損傷或恢復細胞內氧化還原狀態。許多天然產物，如七葉苷、姜黃素等都能通過Nrf2/ARE通路激活Nrf2，從而抵抗氧化應激損傷[26]。

為了研究ERK和PI3K/Akt通路是否參與蝦青素對Nrf2和HO-1的調節，分別加入ERK抑制劑（U0126）和PI3K/Akt抑制劑（LY294002）預處理1 h，然后再加入蝦青素處理24 h檢測Nrf2和HO-1的表達。結果表明U0126和LY294002預處理組中細胞核內的Nrf2的表達明顯下降，同時HO-1的表達也受到了抑制。這表明ERK和PI3K/Akt通路介導了PC-3細胞中Nrf2和HO-1的表達。Choi等[27]研究發現加入ERK抑制劑（PD98059和U0126）能夠抑制Nrf2的核轉移，顯著降低細胞核內Nrf2的表達。Chai Jianshen等[28]研究發現胍丁胺可以通過激活PI3K/Nrf2誘導HO-1的表達來減輕脂多糖引起的ROS積累。陳林等[29]研究表明蛋白激酶C、ERK可能通過上調Nrf2，進而上調γ-GCS的表達。這些結果表明Nrf2和HO-1的表達受到上游多條通路的影響，而其中ERK和PI3K/Akt通路是其中最重要的兩條通路。

進一步研究蝦青素提高H2O2引起的細胞存活率是否經MAPK通路介導，分別加入ERK抑制劑（U0126）、JNK抑制劑（SP600125）和p38抑制劑（SB203580）。結果表明SP600125和SB203580預處理1 h后，并沒有影響蝦青素對PC-3細胞的保護作用，而用U0126預處理1 h后再經蝦青素處理后，細胞的存活率顯著下降，表明蝦青素通過ERK通路來抑制H2O2介導的對PC-3細胞的毒性。

蝦青素能夠顯著降低H2O2誘導的PC-3細胞中ROS的積累，并通過上調Bcl-2/Bax的比率，抑制caspase-3的激活，從而降低細胞的凋亡。蝦青素提高H2O2引起的細胞存活率下降是通過MAPK途徑中的ERK通路，而不是JNK和p38通路；另一方面，蝦青素能通過激活Nrf2，使Nrf2從Keap1-Nrf2的復合體上脫離，從胞質轉入細胞核，進而與ARE結合，上調HO-1的表達以抵抗細胞的氧化應激。蝦青素誘導HO-1表達上調，其上游機制涉及ERK和PI3K/Akt通路。

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