醫院獲得性血流感染來源碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥分析

鐘太清，李毓龍，劉寶濤，蘇維奇*

(1.青島大學附屬青島市立醫院 檢驗科，山東 青島266071；2.簡陽市人民醫院 檢驗科；3.青島農業大學動物科技學院)

血流感染(BSI)是一種嚴重的全身感染性疾病，依發病場所分為社區獲得性血流感染(CABSI)及醫院獲得性血流感染(HABSI)，資料顯示美國每年血流感染占衛生保健相關感染的10%-20%，病死率約為17%[1]。中國醫院內感染的抗菌藥物耐藥監測項目(CARES)結果顯示肺炎克雷伯菌(占比14.8%)是重要的血流感染病原菌，僅次于大腸埃希菌(占比31.0%)，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率約為11%[1]，是臨床血流感染性疾病治療的巨大挑戰。本研究旨在分析我院2016年1月-2017年7月醫院獲得性血流感染患者來源的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐藥特點及機制，為臨床循證用藥，改善醫院獲得性碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌血流感染患者的預后提供依據。

1 資料與方法

1.1研究對象收集2016年1月-2017年7月我院住院患者血培養陽性病原菌株，經鑒定為CRKP共11株(剔除重復)。菌株篩選標準：至少1份血標本分離出典型的病原菌，且與其他部位感染無關；有血流感染癥狀；血標本送檢時入院時間>48 h。菌株經BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統GNI卡進行細菌/藥敏鑒定，K-B瓊脂紙片擴散法及E-test進行體外藥敏補充實驗。

1.2儀器與試劑BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(美國BD公司)，Bio-Rad 170電泳儀、Bio-Rad T100PCR儀及Gel凝膠成像系統[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司]，Oxoid藥敏紙片(北京拜爾迪生物技術有限公司)。PCR試劑盒(大連Takara生物工程有限公司)，引物合成及PCR產物測序由上海派森諾生物科技股份有限公司執行。質控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705 、ATCC BAA1706由青島農業大學劉寶濤老師饋贈。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定/藥敏實驗 所有菌株經BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(美國BD公司)ID-GN及AST-GN卡進行細菌/藥敏鑒定，碳青霉烯類耐藥表型通過亞胺培南試紙條E-test法進行測定[2]，結果按照美國臨床實驗室標準化委員會CLSI2015標準判定。肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705 、ATCC BAA1706作為質控菌株。所有操作按照本實驗室SOP及《全國臨床檢驗操作規程(第四版)》進行。對頭孢菌素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、含酶抑制劑的β-內酰胺類藥物中的3類或者3類以上耐藥者判定為多重耐藥(muiti-drug resistance，MDR)。對目前推薦用于細菌感染經驗治療的藥物(不包括多黏菌素等)均耐藥者視為泛耐藥( pan-drug resistance，PDR)。

1.3.2耐藥基因檢測 細菌DNA提取采用煮沸法，保存于-20℃。所有菌株檢測KPC、 NDM 、BIC、SPM、IMP、 AIM、 VIM 、OXA 、GIM、 SIM、DIM等基因，引物設計及反應條件參考文獻[3,4],PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用Gel凝膠成像系統照相留存結果。

1.3.3MLST分析 肺炎克雷伯菌MLST分型參考Institut Pasteur’s MLST計劃[5]數據庫。

1.3.4質粒接合實驗及分型 液相接合實驗依文獻[6]所述方法，受體菌為鏈霉素耐藥的E.coli C600，用含有2 000 μg/ml 鏈霉素+0.8 μg/ml 美洛培南的雙抗麥康凱平板篩選接合子。

1.3.5PCR產物測序 由上海派森諾生物科技股份有限公司ABI 3730XL DNA測序儀完成。

1.3.6系統發育樹 采用MEGA7.0軟件制作系統發育樹圖，分析菌株之間親緣關系。

2 結果

2.1菌株來源2016年1月至2017年7月血培養陽性結果剔除重復后共分離菌株2124株，其中CRE共31株，占1.5%，CRKP 11株，占0.5%。本研究中的11株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌來自11個不同患者血液標本，3人來自ICU病房，2人來自呼吸科病房，2人來自急診日間病房，1人來自新生兒科病房，1人來自普外科病房，1人來自老年保健科病房，1人來自神經內科病房，相關患者住院期間均有侵入性操作史(表1)。

2.2菌株藥敏結果11株CRKP均顯示為多重耐藥，尤其是對青霉素類，第三代、第四代頭孢全耐藥；3號、7號菌株對亞胺培南中介，對美洛培南耐藥；6號菌株對亞胺培南敏感，對美洛培南中介，其對復方新諾明也敏感；9號菌株對美洛培南中介，對亞胺培南耐藥；3號、6號菌株對阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明均敏感；9號菌株對阿米卡星敏感，對慶大霉素耐藥。所有菌株均產ESBL，但對多粘菌素全敏感(MIC≤0.5)(表2)。

2.3耐藥基因及分子分型PCR及測序分析碳青霉烯耐藥基因，經鑒定10株為KPC，1株為NDM。同時，1、2、3、4號菌株檢出blaCTX-M-6群基因，4、5、7號菌株檢出armA基因，5、8、10號菌株檢出qnr基因。用MLST進行基因分型結果顯示，1、2號菌株鑒定為ST15，3、4、7號菌株鑒定為ST2250，5、11號菌株菌株鑒定為ST2193,6號菌株鑒定為ST1083,8、9、10號菌株為ST23。為進一步研究碳青霉烯耐藥傳播機制，以E.coli C600為受體菌進行液相接合實驗，接合成功4株，對原菌及對應接合菌進行藥敏分析，結果見下表(表3)，接合效率為9×10-7-2.5×10-5cfu/受體菌。對接合子進行PCR分析確定與相應供體菌碳青霉烯基因型相同。各菌株之間親緣關系用MEGA7.0軟件構建系統發育樹，見圖1。

表1 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌臨床資料及分子特征

表2 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯桿菌藥敏結果分析

3 討論

在臨床微生物實驗室中，細菌血癥和真菌血癥的檢測仍然是最重要、最復雜的角色之一，血培養結果可以指導抗生素治療和后續的手術治療、拔除導管的方案和其他的臨床干預措施，在CRKP感染是導致治療失敗和死亡的背景下這種價值更為突出。

表3 接合原菌及接合菌特性及藥敏結果

本文研究了2016年1月至2017年7月從青島市立醫院醫院獲得性血流感染患者分離的11株CRKP的藥敏及耐藥特征，其中2016年分離出4株，2017年分離出7株，分離率有增高趨勢。分析采樣日期發現菌株分離時段主要在冬季，其次為夏季，有學者認為一年中最熱的幾個月肺炎克雷伯菌血流感染分離率是平時的1.5倍[7]，本研究與此不符，可能原因為樣本量少或CRKP分離率不同于KP分離率，與本地流行水平相關。11株CRKP藥敏顯示均為泛耐藥，尤其對第三、第四代頭孢類抗生素全部耐藥，產ESBL， 4株產CTX-M-6群耐藥基因，檢出率36.4%，與臨床大量使用頭孢類抗生素密切相關；阿米卡星耐藥率72.7%稍低于慶大霉素81.8%，可能與阿米卡星對細菌所產鈍化酶較穩定有關，可以與其他抗生素聯合應用；環丙沙星與左氧氟沙星耐藥率均>70%，與既往研究相符[8]，臨床應限制使用。多粘菌素是一種多肽類抗生素，為慢效殺菌劑，不良反應明顯，本研究中多粘菌素100%敏感，在其他抗生素治療效果欠佳時可選用。

圖1 系統發育樹圖

本研究結果表明，本院主要流行的CRKP為產KPC型(10/11)，與既往資料相符[8]。產KPC型CRKP主要是從ICU、呼吸病房、急診日間病房分離出來，且這些患者住院期間均有侵入性操作這一危險因素，結合藥敏結果及CTX、armA、qnr等耐藥基因綜合分析，本研究顯示長期護理單元和相同病區的護理單元易分離出攜帶相同耐藥基因的CRKP，與既往研究結果一致[9]，提示KPC、CTX等可能是通過基因水平傳播獲得。為進一步驗證此種假設，我們進行了液相接合實驗，1、2、4、10號菌KPC基因可液相接合，位于質粒上，且CTX-M-6基因可與KPC基因位于同一質粒上。根據MLST分型結果，1、2號菌均為ST15，系統發育樹圖顯示親緣關系為100%,可以推定為同一克隆。3、4、7號菌均分離自ICU病房，采樣日期相近，且均為ST2250，4、7號菌均攜帶KPC、armA基因，親緣關系>90%,3、4號菌均攜帶KPC、CTX基因，4號菌攜帶KPC、CTX、armA基因，可能為3、7號菌相關耐藥基因水平傳播、嵌合后的子代，雖需要進一步證據支持，但4號菌接合成功證明KPC存在于接合質粒，共軛傳播CTX產KPC酶和CTX-M-6群耐藥基因共存在本研究得到證實。8、10號菌分離自急診日間病房，均攜帶KPC、qnr基因，為ST23，親緣關系>95%,可能為耐藥基因水平傳播所致，已有研究觀察到產KPC型CRKP嵌合qnr后一起水平傳播，更有甚者可以分配到多重耐藥高風險的CC-258中去[10]，這種水平轉移傳播的特點是CRKP多次大規模流行的分子遺傳學基礎。考慮到產酶基因亦可由轉座子、整合子等其他可移動元件介導，具體傳播路徑有待進一步研究。

作者簡介：鐘太清(1990-)，男，在讀碩士，研究方向：細菌耐藥機制及分子流行病學研究。

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