高海拔地區(qū)血液基因組DNA提取條件優(yōu)化

范東艷,杜寶中,王 蘋,全雄杰

(1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩850000;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021;3.西藏阜康醫(yī)院，西藏 拉薩850000)

全血基因組DNA是科學(xué)研究、臨床疾病分析及親子鑒定等許多研究領(lǐng)域不可缺少的原材料。目前，提取DNA的各類方法較多，除各實(shí)驗(yàn)室有自身獨(dú)特的方法外，應(yīng)用最為廣泛的還屬商品化的血液基因組提取試劑盒，不僅使用方便成本低廉且液體量較少相對(duì)污染較低。西藏自治區(qū)地處我國(guó)西南邊疆，平均海拔在3000米以上，由于地勢(shì)高而形成了特有的高原低壓低氧、寒冷干燥的環(huán)境。在高原環(huán)境中提取血液基因組可采用商品化的血液基因組提取試劑盒，但是如果按照試劑盒中說明書方法進(jìn)接提取血液基因組其產(chǎn)量和純度很難滿足后續(xù)研究的需要。本課題組經(jīng)過多次嘗試研究，摸索出了一套血液基因組試劑盒提取DNA的優(yōu)化方法，該方法在高原環(huán)境下提取的DNA能夠獲得滿意的產(chǎn)量和純度。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

2017年5月西藏阜康醫(yī)院體檢的健康體檢者的血液樣品109份作為基因組DNA提取的材料。

1.2主要試劑與儀器

RelaxGene Blood DNA System 血液基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)[天根生化科技(北京)有限公司]，其產(chǎn)品組成：細(xì)胞裂解液CL2×250 ml，緩沖液FG 120 ml，洗脫緩沖液TB60ml，蛋白酶K1 ml。其余試劑為分析純，水為雙蒸滅菌水。

高速臺(tái)式離心機(jī)(Sigma)；超微量紫外可見分光光度計(jì)(Thermo)。

1．3實(shí)驗(yàn)分組

將109份血液樣品的每一份分為2組：實(shí)驗(yàn)組(109份)和對(duì)照組(109份)。

1．4實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1 對(duì)照組按300 μl抗凝血750 μl裂解液提取DNA，具體的操作方法對(duì)照組采用RelaxGene Blood DNA System 血液基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒說明書提取方法。

實(shí)驗(yàn)組按300 μl抗凝血900 μl裂解液提取DNA ，采用RelaxGene Blood DNA System 血液基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)試劑盒，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和方法進(jìn)行優(yōu)化和改良，其方法是：1)將抗凝血樣(2 ml血液/管)從-80℃冰箱中，室溫融化，利用移液器在樣品管中把血樣充分混勻，取300 μl血樣置于尖底離心管中并向管中加入750 μl細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻10次。重復(fù)2次。2)離心12 000 rpm 1 min、 棄上清，將離心管倒置于干 凈吸水濾紙上5 min，此時(shí)確保管底沉淀在管中。3)按100∶1配制FG與蛋白酶K混合液，現(xiàn)用現(xiàn)配。將混合液按照200 μl/管的量加入到已棄上清并倒置5 min的EP管內(nèi)，立即渦旋混勻至無團(tuán)塊。4)65 ℃水浴過夜(20 h)，最初的2 h內(nèi)每10-15 min顛倒混勻2-3次，并用手指彈勻，水浴后可見溶液的顏色從紅色變?yōu)辄S綠色。5)加入異丙醇150 μl，渦旋混勻至絲狀或簇狀DNA為止。6)離心12 000 rpm 5 min、棄上清將EP管倒置于干凈的吸水濾紙上、確保沉淀在EP管中、加入150 μl 70%乙醇、渦旋振蕩5 s、離心12 000 rpm 2 min棄清，再次重復(fù)加入150 μl 70%乙醇、離心棄上清后將EP管倒置于干凈的吸水濾紙上，15 min。6)加入100 μlTB緩沖液，室溫過夜(24 h)。

1．4．2 DNA濃度、純度的檢測(cè)采用紫外線分光光度法[3]。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1DNA不同濃度比例比較實(shí)驗(yàn)組109份樣品中DNA濃度沒有<20 ng/μl，有13份DNA濃度在20-50 ng/μl之間，35份DNA濃度在51-80 ng/μl之間，61份樣品DNA濃度>80 ng/μl； DNA濃度比例高于對(duì)照組見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組DNA不同濃度比例比較(ng/μL)

2.2DNA不同純度比例比較實(shí)驗(yàn)組109份樣品中DNA純度OD260/OD280比值在≥1.7-<1.9之內(nèi)的有105份，比值小于1.7的有3份，比值≥1.9的有1份， DNA純度比例高于對(duì)照組見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組DNA不同純度比例比較(OD260/OD280)

3 討論

臨床醫(yī)學(xué)疾病研究、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等流行病學(xué)的調(diào)查研究都離不開高純度、高分子量的血液基因組(DNA)[1-3]。現(xiàn)今，DNA的提取方法較多，也有多種品牌的提取試劑盒可供選擇使用。但青藏高原平均海拔較高，如果使用常規(guī)化學(xué)方法提取DNA因使用有機(jī)溶劑量較多不但運(yùn)輸不便而且也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。最恰當(dāng)?shù)姆椒ň褪抢醚夯蚪MDNA提取試劑盒提取DNA，不但操作簡(jiǎn)便而且有機(jī)溶劑的使用量也非常小，并可將獲得的DNA直接用于下游實(shí)驗(yàn)[4]。西藏地區(qū)地處高原大氣壓低于平原地區(qū)且干燥低溫對(duì)DNA的提取有一定的影響，本課題組在平原地區(qū)采用天根RelaxGene Blood DNA System 血液基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒提取DNA，按照說明書方法操作，獲得的DNA的濃度和純度均能滿足下游實(shí)驗(yàn)的需求，但在西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(拉薩市平均海拔3600米)采用說明書方法提取DNA時(shí)無論是純度還是濃度均無法滿足下游實(shí)驗(yàn)要求所以經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)總結(jié)提出了天根DNA提取系統(tǒng)在高原地區(qū)使用的改良方案：(1)在300微升抗凝血中加入細(xì)胞裂解液CL由原來的750 μl改為800 μl；(2)加入蛋白酶K FG混合液后65 ℃水浴由原來的10 min改為過夜(20 h)；(3)將說明書上的加入200 μl TB緩沖液改為100 μl，65 ℃水浴1 h改為過夜(24 h)。

在高原環(huán)境提取DNA的過程中，首先將-80℃保存的抗凝血室溫融化后按照改良方案細(xì)胞裂解液使用量為血液的3倍，顛倒混勻10次使DNA分離出來[5,6]；加入蛋白酶K和FG混合液后水浴20 h,樣品溶液透明，推斷由于環(huán)境因素導(dǎo)致裂解時(shí)間延長(zhǎng)；加入TB洗脫液后水浴24 h后采用紫外分光光度法檢測(cè)DNA濃度和純度。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道DNA純度判斷標(biāo)準(zhǔn)：純DNA，其OD260/OD280比值范圍應(yīng)為1．7-1．9；OD260/OD280比值>1．9，表明有RNA污染；OD260/OD280比值<1.6，表明有蛋白質(zhì)等污染[7]。實(shí)驗(yàn)組109份樣品中35份DNA濃度在51-80 ng/μl之間，61份樣品DNA濃度>80 ng/μl； DNA純度OD260/OD280比值在≥1.7-<1.9之內(nèi)的有105份，比值小于1.7的有3份，比值≥1.9的有1份， DNA濃度和純度比例均高于對(duì)照組。

采用改良方法在高原地區(qū)提取的DNA無論是完整性還是濃度純度均能保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的需要同時(shí)適合臨床研究及檢測(cè)應(yīng)用。

作者簡(jiǎn)介：范東艷(1973-)，女，博士,博士后,副教授,主要從事低氧環(huán)境對(duì)機(jī)體健康影響研究。

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