側柏葉生發(fā)酒提取工藝的優(yōu)化

徐晶晶，張可擎，林麗珍，向云亞

（1.廈門醫(yī)學院藥學系，福建廈門361023； 2.河南應用技術職業(yè)學院，河南鄭州450000）

側柏葉為柏科植物側柏（Platycladus orientalis(L.)Franco）的干燥枝梢和葉。中醫(yī)認為側柏葉氣清香，味苦澀，性寒，歸肺、肝、脾經(jīng)，具有涼血止血、化痰止咳，生發(fā)烏發(fā)之功效，用于吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺熱咳嗽、血熱脫發(fā)、須發(fā)早白[1]。側柏葉作為傳統(tǒng)的中藥，其烏發(fā)功能一直被人忽略。而在諸多古今文獻中記載其主要功能為烏發(fā)和生發(fā)，在《本草綱目》中謂其：浸油，生發(fā)，燒汁，黑發(fā)。和豬脂，沐發(fā)長黑[2]。側柏葉單獨或配伍白鮮皮、何首烏、骨碎補等浸酒，浸液外涂患處，治療脫發(fā)效果良好[3]。鮮側柏葉浸泡于60%vol的酒精中，7 d后濾取藥液，涂擦毛發(fā)脫落部位，每日3次可治療脂溢性皮炎與脫發(fā)、發(fā)早白等[4-7]。趙永光等[8]研究認為，側柏葉的生發(fā)烏發(fā)作用主要在于側柏葉總黃酮提取液可激活毛母細胞和促進頭皮血液循環(huán)，復活毛發(fā)生長能力衰退的毛囊和促進血液循環(huán)，增加頭部的營養(yǎng)成分而發(fā)揮養(yǎng)發(fā)、生發(fā)作用。本實驗采用正交試驗設計，以總黃酮含量、槲皮苷含量的綜合評分為指標，考察乙醇體積分數(shù)、料液比、浸提時間對側柏葉生發(fā)酒提取工藝的影響，優(yōu)化側柏葉生發(fā)酒的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

試藥：鮮側柏葉藥材購自北京同仁堂，經(jīng)鑒定為柏科植物側柏（Platycladus orientalis(L.)Franco）的干燥枝梢和葉。蘆丁(四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16101104，純度＞98%)，槲皮苷(四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16080402，純度＞98%)。水為純凈水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

儀器設備：Waters2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，UV-1800紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；CP124C型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；RT-04型粉碎機，北京興時利和科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試驗方法

見實驗步驟及方法。

2 結果與分析

2.1 側柏葉總黃酮的含量測定

2.1.1 供試液的制備

對照液的制備：精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品10.74 mg于小燒杯中，取適量甲醇溶解，轉移至50 mL容量瓶中，定容至50 mL搖勻，即得蘆丁對照品母液（每1 mL中含無水蘆丁0.21 mg）。

樣品溶液的制備：精密量取5 mL側柏葉酒，置于水浴上蒸干，以甲醇溶解，過濾，濾液至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻即得[9]。

2.1.2 實驗條件的選擇

2.1.2.1 吸收波長的確定

取側柏葉酒1號樣品溶液10 mL置于50 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻，放置6 min(不斷振搖)，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻，放置6 min(不斷振搖)，加1 mol/L氫氧化鈉溶液20 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，采用分光光度計法，200～800 nm處掃描，由掃描結果確定測定波長為500 nm[10-11]。

2.1.2.2 標準曲線制備

分別精確量取標準蘆丁溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL和12.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，各加水至12 mL，添加5%的亞硝酸鈉溶液2.0 mL，混勻，放置6 min，加10%的硝酸鋁溶液2.0 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L的氫氧化鈉試液20.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，在分光光度計500 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，得出標準曲線的回歸方程。線性回歸方程為y=11.735x-0.0101，相關系數(shù)R2=0.9996。標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.1.2.3 樣品含量的測定

吸取待測樣液10 mL及10 mL蒸餾水作為空白對照，分別置于50 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻，放置6 min(不斷振搖)，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻，放置6 min(不斷振搖)，加1 mol/L氫氧化鈉溶液20 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，在分光光度計500 nm波長處測定吸光度，對比標準曲線，計算總黃酮含量，結果見表1。

2.1.3 重復性實驗

取待測樣液6份，按照方法2.1.2.3測定樣液的吸光度，根據(jù)標準曲線的回歸方程和稀釋倍數(shù)，計算側柏葉酒中的總黃酮含量，得到RSD=2.59%（n=6），重復性良好。

2.1.4 加樣回收率實驗

取已測定含量的側柏葉酒樣品溶液，按照已知含量的80%、100%、120%加入蘆丁標準品，按照方法2.1.2.3測定回收率，結果見表1。

2.2 槲皮苷含量的測定

2.2.1 色譜條件

表1 側柏葉酒中總黃酮回收率實驗

圖2 側柏葉酒的HPLC

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），流動相為甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液-冰醋酸（40∶60∶1.5），檢測波長 254 nm[1，12]，體積流量1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，見圖2。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮苷對照品4.83 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，添加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取側柏葉酒1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進樣前用0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.2.4 線性關系考察

精密吸取槲皮苷對照品溶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得槲皮苷系列對照品溶液。將各對照品溶液，按2.2.1項中色譜條件測定，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得槲皮苷回歸方程為Y=27595X+629（R2=0.9996），線性范圍為3.864～13.524 μg。

表2 槲皮苷的加樣回收率試驗

2.2.5 精密度試驗

分別取2.2.4項中槲皮苷高、中、低3個質量濃度的對照品溶液，按照2.2.1項中色譜條件，每個濃度分別重復進樣5次，槲皮苷高、中、低質量濃度的RSD分別為0.2%、0.6%、1.0%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h按照2.2.1項中色譜條件進樣，測得槲皮苷質量濃度的RSD為0.6%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗

取側柏葉酒樣品，按照2.2.3項中處理方法平行制備5份，按照2.2.1項中的色譜條件進樣，計算含量。其RSD為0.8%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的側柏葉酒1 mL，分別按含量的80%、100%、120%加入槲皮苷對照品溶液，按照2.2.1項中的色譜條件進樣，計算槲皮苷的平均加樣回收率為100.60%、100.30%、101.01%，RSD為1.89%、1.49%、1.19%，結果見表2。

2.3 側柏葉生發(fā)酒制備工藝的優(yōu)化

選用L9(34)正交試驗，以總黃酮含量、槲皮苷含量的綜合評分為指標，考察乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)和提取時間(C)對提取效果的影響，從而確定最佳提取工藝條件。權重分配總黃酮含量占0.7，槲皮苷含量占0.3。具體計算方法為9個樣品中，每一個樣品的總黃酮、槲皮苷含量分別除以9個樣品中總黃酮、槲皮苷含量的最大值，然后乘以權重系數(shù)，得到總黃酮、槲皮苷含量在該樣本中的綜合評分的貢獻值，同一樣品的總黃酮、槲皮苷含量貢獻值之和即為該樣品的綜合評分[13]。因素水平見表3，試驗安排及結果見表4，方差分析見表5。由表4極差分析結果可知，各因素對結果的影響順序為C＞A＞B，即提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞料液比。由表5方差分析可知提取時間對提取工藝有顯著影響，并根據(jù)綜合評分結果，選擇最優(yōu)工藝條件A1B3C3，即乙醇體積分數(shù)60%，料液比為1∶12，提取時間12 d。

表3 側柏葉生發(fā)酒的提取工藝正交試驗因素水平

2.4 驗證試驗

稱取新鮮側柏葉藥材粉末各6 g，按最佳工藝條件A1B3C3重復3次試驗，驗證該工藝條件的穩(wěn)定性，結果總黃酮的平均含量為12.56 mg/g，槲皮苷的平均含量為1.35 mg/g，結果無顯著性差異，證明該工藝穩(wěn)定可行。

表4 側柏葉生發(fā)酒的提取工藝正交試驗

表5 綜合評分方差分析

3 討論

白發(fā)的病因與發(fā)病機理復雜，現(xiàn)代醫(yī)學研究認為，可能與遺傳、衰老、疾病等導致的黑素干細胞衰老、黑素細胞減少等有關，機制包括bcl-2基因缺失、氧化損傷、氧化應激、微量元素缺乏等。其中，酪氨酸酶(tyrosinase)表達量減少或活性降低是一個重要的因素[14-15]。

側柏葉中所含化學成分復雜，包括黃酮類化合物、鞣質和揮發(fā)油等，可應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品等領域[8]。在諸多古今文獻中記載其主要功能為烏發(fā)和生發(fā)，其中最常用的方法就是將鮮側柏葉浸泡于高濃度的酒精中，濾取藥液，涂擦毛發(fā)脫落部位。但該提取工藝的參數(shù)尚缺乏實驗依據(jù)，都是根據(jù)前人經(jīng)驗而得，本研究考察了乙醇體積分數(shù)、料液比、浸提時間對側柏葉生發(fā)酒提取工藝的影響，優(yōu)化了側柏葉生發(fā)酒的提取工藝。

側柏葉主要含槲皮苷、楊梅樹素、扁柏雙黃酮、穗花杉雙黃酮等黃酮成分[16]。這些成分化學結構中都有可與鋁離子生成具色絡合物的供電子體。因此，本文用比色法測定側柏葉中總黃酮成分含量?！吨袊幍洹肥珍泜劝厝~生品中槲皮苷的含量測定方法，本實驗同時測定兩者含量的變化情況，可為側柏葉生發(fā)酒的質量控制提供科學依據(jù)。

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