濃香型白酒釀造用新型窖泥的初步研究

謝圣凱 ，崔鳳嬌 ，高大禹，許長山，陳建新

（1.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122； 2.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122）

傳統濃香型白酒釀造多在窖池中[1]進行，因為窖泥中存在著己酸菌等功能微生物，其對濃香型白酒風味物質的產生具有重要作用[2]，同時窖泥也可向酒醅中傳輸其發酵過程中積累的揮發性風味物質[3]，但是，窖池中白酒發酵屬于天然發酵[4]，難以實現發酵過程的精準控制。

貴州釣魚臺國賓酒業將換熱器插入窖池酒醅中，對發酵溫度進行控制，結果發現，溫度變化對酵母菌繁殖影響顯著，有利于發酵進行[5]。羅冰等[6]通過將U型換熱管埋入酒醅中控制發酵溫度變化，對比非控溫窖池發現，控溫發酵也能夠釀造出優良的濃香型白酒，可見控溫發酵對于白酒釀造具有積極作用。但是窖池中插入換熱裝置控溫相對麻煩，且不利于白酒機械化程度的提升。

隨著經濟快速發展，我國白酒行業日益走上了機械化發展的道路[7]。蘇占元等[7]在生物反應器中進行白酒固態發酵，釀造出了優質濃香型白酒。劉念等[8]開發出了一種濃香型白酒發酵容器，將窖泥裝在窖壁和窖底的夾層中，提高了白酒釀造的空間利用率。范偉國等[9]研制出了白酒固態發酵罐，將窖泥以掛片的方式敷設在反應器內壁上使用，且其罐體外壁夾套上裝有冷媒，可以準確調控罐內酒醅發酵溫度，從而解決盛夏溫度過高導致酒廠停產的問題。但是，上述濃香型白酒發酵反應器存在的缺點為：（1）窖泥容易脫落進入酒醅中，導致白酒具有泥臭味；（2）黃泥載體窖泥黏附性強，不易取出，導致退化窖泥養護困難[10]；（3）窖泥附著在罐壁上影響傳熱效果。

鑒于生物反應器釀造濃香型白酒仍需窖泥微生物的參與，本文旨在研究一種新型窖泥，將其裝入特定裝置中埋入酒醅發酵，可實現反應器的四周和底部進行換熱，便于控制酒醅溫度。另外，采用人為控制的方法能夠促進窖泥老熟，本文通過對比不同材料作載體培養的窖泥理化和微生物學指標，最終選定一種合適的材料培養窖泥，從而為生物反應器釀造濃香型白酒提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料

窖泥a、窖泥b和窖泥c，某酒廠提供；粉末活性炭、顆粒活性炭，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 菌株來源

產己酸菌XS1分離自某酒廠的白酒車間的窖泥中。

1.2 儀器與試劑

生化培養箱（BSP-250），上海博訊實業有限公司；MGC 2.5 L厭氧產氣袋、MGC 2.5 L厭氧培養袋、氧氣指示劑C-22，日本三菱公司；潔凈工作臺（VS-1300），蘇州凈化設備有限公司。

制霉菌素，生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法

（1）銨態氮測定：連續流動分析儀測定[11]；（2）有效磷測定：Olsen法[12]；（3）窖泥pH值測定：參考沈怡方的方法[13]。

1.3.2 產己酸菌計數[14]

液體樣品計數：取1 mL液體樣品與9 mL無菌生理鹽水混合，低溫振蕩均勻后進行梯度稀釋，選取稀釋液涂布于RCM平板，快速放入厭氧培養袋（內含厭氧產氣袋和氧氣指示劑，厭氧產氣袋在耗盡氧氣的同時會產生大量的CO2，適合厭氧菌培養）中，37℃培養至菌落長出并計數。固體樣品計數：取10 g窖泥于裝有玻璃珠的90 mL無菌生理鹽水中，低溫振蕩10 min，吸取1 mL溶液與9 mL無菌生理鹽水混合，其余操作與液體樣品計數相同。

1.3.3 好氧細菌計數[14]

液體樣品細菌計數：取1 mL樣品與9 mL無菌生理鹽水混合，振蕩均勻后進行梯度稀釋，選取稀釋液涂布LB平板，37℃培養至菌落長出并計數。固體樣品細菌計數：取10 g窖泥于裝有90 mL加有玻璃珠的無菌生理鹽水中，低溫振蕩30 min，吸取1 mL溶液與9 mL無菌生理鹽水混合，其余操作與液體樣品細菌計數相同。

1.3.4 產己酸菌培養液擴大培養

吸取150 μL XS1菌液接種到裝液量90%[15]的含有RCM液體培養基的50 mL三角瓶中，快速放入厭氧培養袋中，于37℃下培養2 d，之后依此類推在500 mL三角瓶中進行擴大培養。

1.3.5 窖泥培養工藝流程[16]

產己酸菌菌種→擴大培養→加入種子窖泥、黃水、酒糟浸出液、乙醇、大曲→復合功能菌液→加入黃泥、種子窖泥、大曲粉、豆餅粉、乙醇、麩皮、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、黃水、干酒糟、酒糟浸出液、水→拌勻→37℃下密封發酵60 d。

2 結果與分析

2.1 產己酸菌液在窖泥培養中的運用

2.1.1 產己酸菌在窖泥培養中的性能測定（表1）

表1 人工窖泥微生物檢測結果

由表1可知，不加種子窖泥、只加產己酸菌液培養的黃泥載體窖泥產己酸菌數量與添加種子窖泥、產己酸菌液培養的黃泥窖泥較為接近，這說明該產己酸菌培養窖泥是可行的。

2.1.2 選定培養窖泥的種子窖泥（表2）

由表2可知，對比含水率、銨態氮、有效磷、好氧細菌和產己酸菌數量可知，窖泥b產己酸菌數量和好氧細菌數量皆最高，其他3項指標也與窖泥a和窖泥c較為接近，故選定窖泥b作為種子窖泥培養窖泥。

2.1.3 選定培養窖泥的載體（表3）

表2 窖泥的理化和微生物學指標檢測結果

表3 各種載體窖泥檢測結果

結合表3、表2，對比窖泥產己酸菌數量可知，粉末活性炭載體窖泥＞顆粒活性炭載體窖泥＞石英砂載體窖泥＞黃泥載體窖泥，并且粉末活性炭載體窖泥和顆粒活性炭載體窖泥產己酸菌數量皆大于窖泥b。分析窖泥好氧細菌數量可知，顆粒活性炭載體窖泥＞粉末活性炭載體窖泥＞石英砂載體窖泥＞黃泥載體窖泥，且顆粒活性炭載體窖泥、粉末活性炭載體窖泥和石英砂載體窖泥好氧細菌數量皆大于窖泥b。

另外，對比銨態氮含量發現，顆粒活性炭、粉末活性炭載體窖泥銨態氮含量與窖泥b、窖泥c較為接近，比黃泥、石英砂載體窖泥銨態氮含量高，從而可為窖泥微生物生長提供所需的主要氮源[17]。

對比有效磷含量可知，粉末活性炭和顆粒活性炭窖泥有效磷含量比石英砂、黃泥載體窖泥高，結合微生物數量分析，這與窖泥中適量的有效磷等無機鹽可為微生物繁殖提供營養的結論相符合[17]。

鑒于窖泥中厭氧菌的數量能反映出窖泥的質量[17]，綜上所述，發現粉末活性炭更適合作窖泥載體，但是，鑒于黃泥作為傳統窖泥的載體由來已久，故進一步探索粉末活性炭與黃泥混合作載體培養窖泥的可行性，跟蹤發酵過程中理化、微生物指標變化，并與黃泥單獨載體窖泥和粉末活性炭單獨載體窖泥進行對比。

2.1.4 粉末活性炭和黃泥混合載體窖泥實驗（培養期間定期取樣）（圖1）

圖1 產己酸菌數量變化

（1）培養期間各載體窖泥產己酸菌數量變化

圖1可知，觀察窖泥產己酸菌數量變化，粉末活性炭載體窖泥產己酸菌數量由開始的1.89×106cfu/g在培養時間為2 d時上升到7.81×108cfu/g窖泥，之后至發酵結束，產己酸菌數量在7.81×108～1.12×108cfu/g窖泥之間波動。分析各窖泥產己酸菌數量可知，粉末活性炭載體窖泥＞黃泥、粉末活性炭混合載體窖泥＞黃泥、粉末活性炭、顆粒活性炭混合載體窖泥≈黃泥載體窖泥。

（2）窖泥培養期間好氧細菌數量變化（圖2）

由圖2可知，發酵后期各載體窖泥好氧細菌數量較為接近，各載體皆適合好氧細菌生長。

（3）各載體窖泥培養期間含水率和pH值的變化（圖3、圖4）

圖2 好氧細菌數量變化

圖3 窖泥含水率變化

由圖3可知，各載體窖泥培養期間含水率波動不大，其中粉末活性炭載體窖泥含水率最高，黃泥載體含水率最低。由圖4可知，黃泥載體窖泥在發酵22 d后pH值為4.4左右，之后至發酵結束基本波動不大；而其他3種載體窖泥發酵22 d后，pH值基為5.4以上，鑒于優質窖泥pH值一般處于5～7范圍內[18]，顯然黃泥、粉末活性炭、顆粒活性炭混合載體，黃泥、粉末活性炭混合載體，粉末活性炭載體更適合微生物繁殖。綜上所述，結合產己酸菌、好氧細菌、pH值指標分析，最終得出選擇粉末活性炭作窖泥載體是合適的。

圖4 窖泥pH值變化

2.1.5 粉末活性炭和黃泥混合載體窖泥實驗（培養期間不取樣）（表4）

表4 各種載體窖泥檢測結果

由表4可知，產己酸菌方面，只有黃泥載體窖泥培養60 d后產己酸菌數量低于初始水平，其他3種載體窖泥培養60 d后產己酸菌數量均高于初始值，尤以粉末活性炭載體窖泥產己酸菌數量增長幅度最大，結合表2可知，其比窖泥b產己酸菌數量更高。對比窖泥好氧細菌數量可得，發酵60 d后，黃泥載體窖泥＞黃泥、粉末活性炭、顆粒活性炭混合載體窖泥＞粉末活性炭載體窖泥＞黃泥、粉末活性炭混合載體窖泥。觀察pH值發現，發酵結束后的黃泥載體窖泥pH4.87，而其他3種窖泥pH值都處于5～7之間，更有利于微生物的繁殖。含水率方面，窖泥培養初始和培養60 d后含水率起伏不大，其中黃泥載體窖泥含水率最低，粉末活性炭窖泥含水率最高。另外，對比圖1可知，取樣操作確實對各種人工窖泥培養造成了不同影響，但是粉末活性炭載體窖泥產己酸菌數量受取樣影響最小，可見粉末活性炭穩定性也較好。

另外，實驗發現，黃泥載體窖泥、黃泥+粉末活性炭+顆粒活性炭混合載體窖泥和黃泥+粉末活性炭混合載體窖泥相比，粉末活性炭載體窖泥黏附性更強，不具有靈活的形狀可塑性，綜上所述，最終選擇粉末活性炭作載體培養窖泥。

3 結論

將高產己酸的XS1菌株分別運用到黃泥、石英砂和活性炭載體窖泥的培養，發現粉末活性炭材料最適合作為窖泥培養的載體。其窖泥中產己酸菌數量相比黃泥載體窖泥、石英砂載體窖泥、顆粒活性炭載體窖泥、黃泥+粉末活性炭載體窖泥、黃泥+粉末活性炭+顆粒活性炭載體窖泥都要高，發酵時間為60 d的窖泥中產己酸菌數量能達到7.91×108cfu/g窖泥，且受外界因素影響波動小；窖泥發酵60 d后的好氧細菌數量能達到1.04×107cfu/g窖泥，其窖泥pH值基本處于5～7之間，符合優質窖泥的要求，有利于窖泥功能微生物的繁殖；其窖泥銨態氮含量、有效磷含量都與各酒廠窖泥接近，能夠滿足微生物的生長所需的氮源和無機鹽成分。同時，粉末活性炭窖泥相比其他載體窖泥具有更好的形狀可塑性，適合在固定裝置中填裝使用，這樣窖泥不會脫落到酒醅中，窖泥養護較為便捷，也不會影響傳熱，同時，粉末活性炭材料成本低，耐酸堿，化學性質穩定，具有較大的比表面積，有利于固定微生物[19]。

鑒于窖泥和酒醅中微生物繁多，反應機制復雜，本文只是專注于窖泥中產己酸菌和好氧細菌的研究，這具有一定的局限性，故還需深入研究窖泥和白酒發酵相關機理。另外，粉末活性炭載體窖泥在生物反應器中使用的最佳方式、實際使用效果還有待深入研究。

[1]任劍波,姚萬春,唐玉明,等.不同材質窖池的酒醅微生物分布差異[J].釀酒,2015,42(5)：22-25.

[2]范文來,徐巖.白酒窖泥揮發性成分研究[J].釀酒,2010,37(3)：24-31.

[3]蔡鵬飛,邵傳貞,姚慶樂,等.窖泥在釀酒中的兩個作用[J].釀酒,2011,38(5)：59-61.

[4]郎召偉.瀘型酒釀造過程中風味物質變化分析[D].無錫：江南大學,2015.

[5]鄒明鑫,吳鳳智,高文龍.溫度控制下濃香型白酒窖池溫度變化及酵母數量變化趨勢研究[J].食品與發酵科技,2015,51(2)：82-86.

[6]羅冰.控溫發酵對濃香型白酒品質變化趨勢的研究[J].釀酒科技,2014(1)：108-114.

[7]蘇占元,張良,張宿義,等.生物反應器中糟醅發酵動態的研究[J].釀酒科技,2015(6)：61-64.

[8]劉念,王超凱,彭奎,等.濃香型白酒發酵容器：CN202401048U[P].2012-08-29.

[9]范偉國,喬新建,龐相國,等.白酒固態發酵罐：CN102586054A[P].2012-07-18.

[10]蘇占元,張宿義,周海燕,等.新型動態固態生物發酵反應器的研究及應用進展[J].釀酒科技,2014(10)：82-84.

[11]CROOKE W M,SIMPSON W.Determination of ammonium in Kjeldahl extracts of crops by an automated procedure[J].Journal of the science of food and agriculture,1971(22)：9-10.

[12]OLSEN S R.Estimation of available phosphorus in soils by extraction with sodium bicarbonate[R].Washington:United States Department of Agriculture,1954.

[13]沈怡方.白酒生產技術全書[M].北京：中國輕工業出版社,1998：642.

[14]熊君燕,李小東,陳建新,等.清香型白酒中乳酸菌和酵母菌的相互作用[J].微生物學通報,2017,44(8)：1767-1776.

[15]彭兵,祝熙,張部昌,等.窖泥高產己酸菌分離鑒定及培養條件優化的研究[J].中國釀造,2016,35(5)：43-46.

[16]姚萬春,唐玉明,劉淼,等.功能性人工窖泥培養配方篩選研究[J].中國釀造,2014,33(8)：63-66.

[17]侯銀.林分結構對楊樹人工林土壤微生物多樣性的影響[D].南京：南京林業大學,2013.

[18]景曉衛,唐玉明,姚萬春,等.人工老窖發展及其研究現狀[J].釀酒科技,2010(9)：77-80.

[19]周仁忠,王建忠,劉宏媛,等.固定化窖泥功能微生物電鏡表征觀察及連續產酸性能的研究[J].釀酒,2012,39(2)：79-84.