濃香型大曲中4-乙基愈創木酚產生菌的篩選及其鑒定

王少磊，曹榮升，沈 芳，項興本，顏守保

（安徽迎駕貢酒股份有限公司，安徽霍山237200）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，其中以濃香型白酒為主，濃香型白酒產量占全國白酒行業總產量的70%以上[1-3]。濃香型白酒香味成分復雜、多樣，其主體香味成分為醇類、酯類、酸類、醛類、酮類，此外，愈創木酚類、呋喃類、芳香族類以及吡嗪類化合物也為濃香型白酒的復合香氣作出了重要貢獻[4-5]。4-乙基愈創木酚(4-ethyl guaiacol,簡稱4-EG)是愈創木酚類的一種，又名4-乙基-2-甲氧基苯酚(4-ethyl-2-methoxy-pheno1)，分子式為 C9H12O2，為無色或淡黃色油狀液體，呈發酵香氣，略帶甜味，微帶酚的氣息。4-乙基愈創木酚是一種天然呈香化合物，對白酒香氣具有重要的貢獻，它是自由基清除劑，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧化和預防心血管等多種疾病的發生，具有預防疾病、抗衰老、促進人體健康的作用[6-8]。通常通過以下3種方法制備4-乙基愈創木酚，一是從天然木油中精餾，二是由愈創木酚或香莢蘭乙酮人工合成，三是通過生物轉化，其中精餾提取操作復雜，成本高；人工合成所需要的反應條件比較苛刻，且因需要劇毒的鋅汞參與反應，難以工業化；而生物轉化法具有周期短、反應條件溫和、價格低廉、無污染、生產成本低等優點，已引起各國研究者的高度關注[9-10]。在中國白酒中，4-乙基愈創木酚是呈香組分，而微生物的生物轉化是其重要的來源之一，因此本實驗從濃香型白酒大曲中篩選分離獲得1株4-乙基愈創木酚產生菌株，根據分離菌株生理生化、形態的研究并結合16S rDNA序列分析鑒定其種屬關系，為白酒行業中4-乙基愈創木酚的生物合成提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：大曲樣品由安徽迎駕貢酒股份有限公司提供。

試劑：2-辛醇、4-乙基愈創木酚均為標準物質，購自德國Dr.E公司；其他試劑均為分析純或生化試劑。

儀器及設備：滅菌鍋、生化培養箱、氣相色譜-質譜聯用儀(安捷倫7890A-5975C)/高速離心機等。

1.2 培養基

(1)平板分離培養基。LB培養基的配制(1 L)：稱取胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，瓊脂20 g，溶于1000 mL蒸餾水中，調 pH7.2～7.4，120℃滅菌30 min。

(2)種子液培養基。LB培養基的配制(1 L)：稱取胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，溶于1000 mL蒸餾水中，調節pH 7.2～7.4，120℃滅菌30 min。

(3)發酵培養基。麩皮培養基(250 mL三角瓶)：麩皮5 g，加水95 mL，混勻分裝后，以115℃濕熱滅菌20 min。

1.3 培養條件

種子液培養條件：從新鮮斜面上挑取數環菌落至LB培養基中（每250 mL搖瓶裝100 mL培養基），于37 ℃、160 r/min下培養24 h。

發酵培養條件：將培養好的種子液，按5%的接種量（v/m）接入麩皮培養基(每250 mL搖瓶裝100 g培養基)中，于37℃、160 r/min條件下培養。

1.4 產4-EG菌株篩選方法

1.4.1 產4-EG菌株的篩選

稱取5 g大曲，研磨成粉末，加入裝有95 mL無菌水的250 mL三角瓶中，振蕩打散后，再將獲得的懸液按10倍梯度稀釋到10-6，取各稀釋液0.1 mL，分別涂布LB培養基平板，37℃培養24 h。挑取單菌落經劃線分離為純菌落，接種于LB培養基瓊脂斜面，37℃培養24 h后4℃保藏備用。

1.4.2 產4-EG菌株的復篩

分離菌株經活化后，分別接入發酵培養基中，振蕩培養(37℃、160 r/min)6 d后，過濾發酵液，以2-辛醇作為內標，4-EG為外標，通過GC-MS檢測揮發組分中4-EG含量。

1.5 菌株鑒定的形態特征與鑒定

1.5.1 菌株的形態特征

(1)對分離到的菌株進行革蘭氏染色，觀察菌體在固體平板上的形態、顏色、黏稠度、光澤度、菌落邊緣隆起情況、菌落的透明度等菌落特征，并在電子顯微鏡下觀察菌體的顯微形態。

(2)將培養過夜的菌液涂布于無菌一次性塑料平板上，在無菌工作臺上自然晾干后，用無菌手術刀將平板切成1 cm×1 cm的小方塊，用1%戊二醛于4℃冰箱中固定1 h，用磷酸緩沖液（PBS）沖洗2次，于4℃冰箱中，依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇脫水各5 min，最后自然干燥。將所制樣品放置于銅片上，于SPI-Module control設備中鍍金，然后將樣品放于掃描電鏡樣品室中抽真空，掃描成像。

1.5.2 菌株的部分生理生化特性鑒定

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》第九版[11]及《常見細菌系統鑒定手冊》[12]對分離得到的菌株進行了一系列生理生化鑒定實驗，包括接觸酶、氧化酶、葡萄糖氧化發酵、蔗糖發酵、木糖發酵、乳糖發酵、半乳糖、吲哚試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、硫化氫試驗、尿素水解試驗、檸檬酸鹽利用、苯丙氨酸脫氨酶、淀粉水解、脂肪水解和明膠水解等。

1.5.3 菌株的分子生物學鑒定

(1)目標菌株的基因組總DNA提取

菌體制備和裂解：2 mL新鮮菌體培養液，12000 r/min、4 ℃離心5 min，1 mL TE重懸，洗滌并離心；加溶菌酶至100 μg/mL終濃度，37℃下保持1 h至溶液變清；加10%SDS至2%終濃度，加蛋白酶K至100 μg/mL終濃度，50℃下保持3 h。

DNA抽提：加1/3體積的飽和NaCl，劇烈振蕩15 s，以4 ℃、12000 r/min 離心10 min，取上清液轉入5 mL離心管中；用等體積的酚、氯仿、異戊醇抽提2次，再用氯仿抽提2次，取上清液。

DNA沉淀：上清液加入等體積異戊醇沉淀DNA，室溫放置30 min后，12000 r/min離心15 min，取下層沉淀，用70%vol乙醇洗滌3次，晾干加30～50 μL雙蒸水或TE，-20℃保存備用。

(2)目標菌株的16S rDNA序列PCR擴增

16S rDNA序列分析法是目前細菌種屬鑒定中常用的快速分子生物學方法，采用16S rDNA擴增通用引物，以目標菌株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。

引物27F(5'-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3'),1541R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')，上海生工生物公司合成。

PCR反應體系（25 μL）：

10×Taq buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，10 mM dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL，primer(10 mmol/L）各2.5 μL，Taq polymerase 0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 13 μL。

PCR反應條件：

（3）目標菌株系統發育樹的構建

16S rDNA測序由上海生物工程技術有限公司完成，測序結果采用Chromas參照正反序列圖譜人工校對。校正后的16S rDNA序列在GenBank數據庫中進行同源序列BLAST比對。采用Clustal X1.8對從GenBank數據庫中下載的模式菌株以及試驗菌株序列進行比對(Aligment)后，采用BioEdit手工刪除兩端不齊序列，再用MEGA 5.0構建系統發育樹，并進行1000次bootstraps檢驗計算支持率。

1.6 4-EG分析方法

(1)氣相色譜-質譜（GC-MS）分析條件

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱(30m×0.25mm×0.25 μm)；進樣口溫度280℃；程序升溫：初始柱溫65℃，保持3 min，以5℃/min升溫至150℃，保持2 min，再以10℃/min升溫至280℃，保持4 min；載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速0.8 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比20∶1；進樣量：1 μL。

質譜條件：電離方式：EI；監測方式：全掃描模式，質量范圍45～600 amu；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；溶劑延遲：3 min。

(2)定量分析

以2-辛醇為內標，4-EG為外標，將樣品中4-EG的峰面積與內標2-辛醇的峰面積之比，和標準品中4-EG的峰面積與內標2-辛醇的峰面積之比相互比較，計算出樣品中4-EG的含量。

2 結果與討論

2.1 4-EG產生菌株的篩選

將大曲樣品經過多次稀釋和劃線分離，根據平板上菌落的形態、顏色、黏稠度、光澤度、菌落邊緣隆起情況、菌落的透明度等菌落特征，初步篩選分離獲得16株菌株，從形態上判斷均為細菌，分別將這些菌株進行產4-EG試驗。利用GC-MS檢測發酵產物中揮發性組分，以揮發性組分中的4-EG含量為基準，經過篩選獲得1株4-EG產量較高的菌株(見表1)，該菌株(EG06)4-EG產生量可達32.89 μg/g發酵產物。因此，選取該菌株作進一步的菌種鑒定。

表1 產4-EG菌株的初篩結果

2.2 菌株EG06的鑒定

2.2.1 菌株EG06的形態學特征和部分生理生化鑒定

菌株EG06革蘭氏染色陽性，在平板上菌落呈圓形，中央隆起，表面光滑細密，中等濕度，邊緣整齊，乳白色不透明，不產生色素(見圖1A)。液體培養基中無菌膜,菌液渾濁,有沉淀產生。在電子顯微鏡下，細胞為桿狀，菌體直徑為1.5～2.3 μm。單一、成對或形成小叢集(見圖1B)。

菌株EG06能夠在10～45 ℃，pH3～8，NaCl小于8%的條件下生長。發酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖，但不能發酵木糖。氧化酶試驗、接觸酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗和脂肪水解試驗為陽性；苯丙氨酸脫氫酶試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、硫化氫試驗、明膠液化試驗和尿素水解試驗陰性。依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》，發現菌株EG06有芽孢桿菌屬的典型特征，因而可以初步確定為芽孢桿菌，還需要進一步的分子生物學鑒定。

2.2.2 菌株EG06的分子生物學鑒定

獲得EG06基因組總DNA后，以總DNA為模板，引物為16S rRNA通用引物，進行PCR擴增16S rRNA部分序列。擴增后得到大約1700 bp目的片段(見圖2)。

圖2 菌株EG06的16S rRNA PCR產物電泳圖

利用16S rDNA通用引物測序，結果表明菌株EG06的16S rDNA目的片段核苷酸序列全長約1578 bp。采用NCBI提供的BLAST程序將該序列與Genebank中已注冊的16S rRNA基因序列進行同源性比對，結果顯示，該菌株與芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的幾個種之間同源性均達到98%。因此，可以判斷該菌株屬于芽孢桿菌屬。

采用ClustalX1.8對GenBank中的已知序列以及測得的序列進行比對后，采用BioEdit手動刪除兩端不齊序列，再用MEGA5.0采用最大簡約法構建系統發育樹(見圖3)。系統發育樹分析表明菌株EG06與芽孢桿菌屬多株菌株的進化親緣關系很近，并且Bootstrap檢驗也達到了100%，因此，結合EG06的形態學和生理生化特征，該菌株應是芽孢桿菌屬中的一個種，為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名為Bacillus amyloliquefaciens EG06。

2.3 代謝產物分析

將菌株Bacillus amyloliquefaciens EG06接入發酵培養基中，37℃、160 r/min培養6 d后過濾發酵液，以2-辛醇作為內標，通過GC-MS檢測發酵液中揮發性組分并對其半定量。發酵上清液經GCMS檢測，檢測出23種揮發性組分，如亞麻酸乙酯、2，3-丁二醇、異丁酸、異辛酸、4-EG、1-石竹烯、油酸乙酯等(見圖4)。其中，酯類占16.4%，醇類占35.4%，烷烴類占3.7%，酸類占25.3%，酚類物質占19.2%。這23種揮發性組分中4-EG所占總峰比例最高，為14.2%。

3 結論

4-乙基愈創木酚是一種天然呈香化合物，對白酒香氣具有重要的貢獻，目前國內研究較少，國外報道較多。本研究從濃香型大曲中分離出1株具有較高4-EG產生能力的菌株，4-EG產量可達32.89 μg/g發酵產物，編號為EG06。通過對其菌落及菌體形態進行觀察、生理生化實驗、16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為Bacillus amyloliquefaciens。

圖3 菌株EG06的16S rDNA系統發育樹及分類地位，Bootstrap檢測大于50%的被標明在分枝上

圖4 菌株EG06發酵液揮發性組分的總離子色譜圖

[1]袁先鈴,黃丹,彭建.濃香型大曲中優勢蛋白酶產生細菌的分離及產酶條件研究[J].釀酒科技,2012(8)：54-57.

[2]游玲,顏勝濤,王濤,等.復合菌在濃香型白酒丟糟處理中的應用[J].微生物學通報,2014,41(8)：1525-1531.

[3]郎召偉.瀘型酒釀造過程中風味物質變化分析[D].無錫：江南大學,2015.

[4]王濤,游玲,趙東,等.濃香型白酒釀造相關放線菌揮發性產物分析[J].食品科學,2012,33(14)：184-187.

[5]胡沂淮,蔡楠,戴源,等.濃香型白酒堆積發酵酒醅揮發性成分分析[J].釀酒科技,2014(3)：93-96.

[6]張金修,李靜,郭芳文.白酒中微量成分對人體的作用[J].釀酒科技,2014(10)：143.

[7]周金虎,管健,魏浩林,等.白酒中健康因子的研究進展[J].釀酒科技,2017(7)：90-94.

[8]陳雙,陳華蓉,吳群,等.應用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜技術解析釀造用高粱蒸煮揮發性香氣成分[J].食品與發酵工業,2017,43(4)：201-207.

[9]陳恩治,金濤.4-乙基愈創木酚的合成[J].香料香精化妝品,2010(3)：30-32.

[10]魯伶蘭,馬錦明,張書明.4-乙基愈創木酚的合成研究[J].天津化工,2000(6)：27-28.

[11]JOHN G H,NOBEL R K,PETER H A.Bergey’s manual of determinative bacteriology[M].9th ed.Baltimore:Williams and Wilkins Press,1994.

[12]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社,2001.