超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定酒類中紐甜

黃 坤，王幸平，范小龍，吳婉琴，王會(huì)霞，郭 嘉

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢430075； 2.湖北生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，湖北武漢430075； 3.武漢工程大學(xué)綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430074)

紐甜（neotame）是一種新型的強(qiáng)力甜味劑，甜度約為蔗糖的10000倍、阿斯巴甜的40倍，其甜味純正，無(wú)苦味和金屬味，且價(jià)格相對(duì)便宜，因此廣泛應(yīng)用于各類食品中[1]。GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定紐甜可在各類食品中按規(guī)定使用，但根據(jù)要求紐甜在黃酒、米酒以及果酒中可適量使用（≤0.033 g/kg），而在白酒和葡萄酒中則不得使用[2]。

目前最常用的食品中紐甜的檢測(cè)方法有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[3-5]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法[6]、流動(dòng)注射法[7]等，其中最常用的是高效液相色譜法，目前已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.247—2016[8]，該方法取代了舊標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23378—2009，但標(biāo)準(zhǔn)適用范圍縮小，不再包括酒類，同時(shí)該方法操作復(fù)雜，靈敏度不高，且使用離子對(duì)試劑檢測(cè)系統(tǒng)平衡時(shí)間較長(zhǎng)，不適用于酒類中紐甜的快速檢測(cè)。因此建立一種酒類中紐甜快速測(cè)定的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法十分有必要，能為酒類的監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)，從而保證酒類的飲用安全，有效地促進(jìn)酒類市場(chǎng)健康有序的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

樣品：市售白酒、葡萄酒、黃酒、米酒、果酒各類酒品。

儀器設(shè)備：超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（XEVO TQ-S），美國(guó)Waters公司；Masslynx 4.1色譜質(zhì)譜管理軟件；電子天平（ME2002E、XS204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；翻轉(zhuǎn)式混勻器（Trayster digital），德國(guó)艾卡公司；離心機(jī)（Allegra X-15R），美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

試劑：紐甜（純度98.0%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲酸（色譜級(jí)），美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；超純水（自制）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取紐甜標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；準(zhǔn)確移取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中，用超純水稀釋配制成1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用流動(dòng)相再逐級(jí)稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品溶液的制備

稱取酒類樣品5 g左右水浴除酒精后置于50 mL離心管中，加入30 mL的超純水，翻轉(zhuǎn)混勻30 min后定容至刻度，以4000 r/min離心5 min，過(guò)0.22μm的有機(jī)系濾膜，取濾液供測(cè)定。

1.4 液相及質(zhì)譜條件

1.4.1 LC條件

WatersBEHC18色譜柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相由乙腈和0.1%的甲酸水溶液組成，流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序0 min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)為5%；0～0.3 min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)保持為5%；0.3～0.8 min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)從5%升至65%；0.8～3.2 min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)從65%升至95%；3.2～3.3 min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)保持為95%；3.3～3.4 min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)從95%降至5%；3.4～5.0 min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)保持為5%。柱溫為40℃；進(jìn)樣體積：5μL。

1.4.2 MS-MS條件

質(zhì)譜儀選擇電噴霧離子源，負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓為2.50 kV，脫溶劑氣和錐孔氣流量分別設(shè)定為700 L/h和50 L/h，離子源溫度和脫溶劑氣溫度分別為150℃和350℃。

1.5 定性及定量

將上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液在1.4方法下測(cè)定，根據(jù)保留時(shí)間和相對(duì)離子豐度比進(jìn)行定性，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)定量離子對(duì)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜參數(shù)的選擇

2.1.1 色譜參數(shù)的選擇

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室前期使用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器對(duì)紐甜的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乙腈-磷酸氫二鈉流動(dòng)相體系分離效果較好，但由于磷酸氫二鈉不易揮發(fā)，不適宜質(zhì)譜分析。本研究分別考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%乙酸銨、乙腈-水、乙腈-0.1%三乙胺作為流動(dòng)相進(jìn)行樣品測(cè)定。結(jié)果表明，除乙腈-0.1%三乙胺流動(dòng)相體系信號(hào)響應(yīng)略低外，各體系差異不大，綜合分離效果、響應(yīng)強(qiáng)度和測(cè)定時(shí)間考慮，最終選擇乙腈和0.1%的甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，紐甜的峰型對(duì)稱，保留時(shí)間適宜。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

通過(guò)流動(dòng)注射進(jìn)行質(zhì)譜全掃描得到紐甜的一級(jí)質(zhì)譜圖，用氬氣轟擊母離子得到二級(jí)質(zhì)譜圖，實(shí)驗(yàn)表明，紐甜在負(fù)離子模式下響應(yīng)值高于正離子模式，對(duì)紐甜的定性和定量離子進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，所得最佳質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下紐甜的總離子流色譜圖和子離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 紐甜的質(zhì)譜分析參數(shù)

圖1 紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖和子離子流圖

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

白酒、葡萄酒、黃酒、米酒以及果酒等酒類樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，且含有一定比例的乙醇，直接進(jìn)樣分析，會(huì)影響保留時(shí)間和峰型，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性不佳。本方法采用水浴除酒精后稀釋進(jìn)樣，可以降低基質(zhì)效應(yīng)，考慮到檢出限的原因稀釋倍數(shù)定為10倍（米酒樣品可視渾濁情況采取離心后稱量或增大稀釋倍數(shù)特殊處理）。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用流動(dòng)相稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.4和2.1所確定的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C對(duì)定量離子對(duì)的峰面積Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，紐甜質(zhì)量濃度在1～50 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程：Y=1676.03C-169.22，R2=0.991。紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖如圖1所示。以S/N=3結(jié)合實(shí)際基質(zhì)情況確定檢出限為0.05 mg/kg。

表2 5種酒類中紐甜的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.4 方法的精密度和回收率

準(zhǔn)確稱取一定量的白酒、葡萄酒、黃酒、米酒以及果酒等酒類樣品，用微量移液器分別準(zhǔn)確加入濃度為0.050 mg/kg和0.200 mg/kg的紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)條件處理得到的樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，5種酒類每個(gè)加標(biāo)濃度進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其回收率和相對(duì)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，紐甜的回收率為76.90%～101.55%，相對(duì)偏差小于8%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合實(shí)驗(yàn)測(cè)定需求。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

按本文所建立的方法，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃監(jiān)測(cè)的白酒（陽(yáng)性樣）、葡萄酒、黃酒、米酒（陽(yáng)性樣）以及果酒等5個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果測(cè)得白酒和米酒中紐甜的濃度分別為0.827 mg/kg和1.02 mg/kg，均為市售較為低檔的酒類，說(shuō)明市售的相關(guān)酒類產(chǎn)品存在非法添加紐甜的可能性，同時(shí)也表明對(duì)該項(xiàng)目的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估顯得尤為必要。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)所建立的測(cè)定5種酒類中紐甜的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。將該方法用于酒類中低含量紐甜的測(cè)定，前處理方法簡(jiǎn)單，回收率符合要求，能夠?yàn)榫祁惍a(chǎn)品中紐甜含量的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)依據(jù)。

[1]魏志勇,劉穎秋,佘志剛.紐甜的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2008,29(12)：252-255.

[2]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)：GB 2760—2014[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2015.

[3]曹峰,許霞.高效液相色譜法測(cè)定萊蕪姜酒中的紐甜含量[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2014,32(6)：77-80.

[4]王齊,朱偉偉,楊俊.高效液相色譜法快速篩查與測(cè)定葡萄酒中紐甜[J].食品科學(xué),2013,34(4)：154-156.

[5]彭飛進(jìn).高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜含量[J].云南化工,2012,39(5)：45-47.

[6]武金忠,鐘其頂,王昌祿,等.UPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定白酒中六種甜味劑方法初探[J].釀酒,2008,35(1)：65-68.

[7]楊雙春,王健,劉慧芳,等.六種非能量型甜味劑的檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)調(diào)味品,2013,38(1)：105-107.

[8]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測(cè)定：GB 5009.247—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.