Mcl-1 siRNA轉染對EC9706細胞紫杉醇化療敏感性的影響

秦甜甜，劉衛華，張雪燕，李蕾蕾，霍俊峰，石曉麗，王 淙

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

Mcl-1作為Bcl-2家族蛋白之一，在腫瘤的發生發展中起到重要的抑制凋亡作用。研究[1-2]表明多種癌癥中Mcl-1的過度表達導致細胞凋亡抑制并產生腫瘤細胞耐藥現象。食管癌的死亡率在全世界范圍內排名第六[3]。在我國食管癌以食管鱗癌為主，是常見的消化系統惡性腫瘤之一[4]。臨床上常使用紫杉醇聯合化療治療食管鱗癌。本實驗旨在探討基因靶向治療與傳統化療藥紫杉醇聯合作用對食管鱗癌EC9706細胞增殖和凋亡的影響，為食管鱗癌的治療提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1材料正常食管上皮Het-1細胞及食管鱗癌EC9706細胞株由鄭州大學藥物研究院保存。RPMI 1640培養基、胰蛋白酶消化液及BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)，標準胎牛血清(以色列BI公司)，Mcl-1和β-actin抗體(南京恩晶生物公司)，凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，LipofectamineTM2000 轉染試劑及Mcl-1 siRNA(上海吉瑪基因公司)。

1.2細胞培養Het-1及EC9706細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在37 ℃、體積分數5%CO2加濕環境中培養，2～3 d傳代1次，隔天更換培養基，取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.3Westernblot檢測兩種細胞中Mcl-1蛋白的表達收集Het-1細胞及EC9706細胞，PBS清洗2遍，加入裂解液置于冰上裂解30 min，低溫離心機4 ℃、12 000 r/min離心4 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。100 ℃水浴變性后通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用濕轉法將目標蛋白轉移至硝酸纖維素膜。含5 g/L脫脂牛奶的Tris緩沖鹽水室溫下封閉1～2 h，加入一抗(Mcl-1 按1500稀釋, β-actin按15 000稀釋)后在4 ℃環境下孵育過夜。TBST洗膜3次，在室溫下加二抗孵育2 h。ECL發光顯色拍照。使用Image J軟件分析條帶，以目的條帶和β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4Mcl-1siRNA細胞轉染取對數生長期的EC9706細胞接種至6孔板，細胞過夜貼壁后，按照轉染試劑操作說明書，將30 nmol/L Mcl-1 siRNA(正義鏈:5’-CCAAGGCAUGCUUCGGAAATT-3’;反義鏈:5’-UUUCCGAAGCAUGCCUUGGTT-3’)， 通過轉染試劑LipofectamineTM2000轉入EC9706細胞中。以未轉染細胞為對照。24 h后收集細胞，采用Western blot法檢測Mcl-1蛋白表達水平，以評價干擾效果。

1.5細胞增殖檢測分別收集轉染和未轉染Mcl-1 siRNA的EC9706細胞，用完全培養基稀釋后以每孔4 500個細胞的密度接種至96孔板。細胞過夜后分別加入含0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L紫杉醇的培養基，即Mcl-1 siRNA+紫杉醇組與紫杉醇組。48 h后，每孔加入20 μL 500 mg/L MTT，37 ℃繼續孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床振蕩10 min，570 nm處測定吸光度。增殖抑制率=(對照孔吸光度-實驗孔吸光度)/(對照孔吸光度- 空白孔吸光度)×100%。實驗重復3次。

1.6細胞凋亡檢測收集轉染和未轉染Mcl-1 siRNA的EC9706細胞接種至6孔板，加入含0.4 μmol/L紫杉醇的完全培養基繼續培養24 h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作，主要步驟如下：每孔細胞收集后重懸于500 μL Binding buffer，5 μL Annexin V和5 μL PI避光染色15 min。使用BD LSRFortessaTM流式細胞儀在1 h內上機檢測細胞凋亡情況。另設未轉染也未經紫杉醇處理的EC9706細胞為空白對照。實驗重復3次。

1.7統計學處理使用SPSS 17.0處理數據。采用兩獨立樣本t檢驗比較Het-1細胞及EC9706細胞Mcl-1蛋白表達的差異及評價轉染效果，采用2× 9析因設計的方差分析比較轉染和未轉染Mcl-1 siRNA的EC9706細胞經不同濃度紫杉醇處理后細胞增殖抑制率的差異，采用單因素方差分析比較空白對照、經紫杉醇處理的EC9706細胞及轉染Mcl-1 siRNA并經紫杉醇處理的EC9706細胞凋亡率的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1正常細胞和食管鱗癌細胞中Mcl-1蛋白的表達結果見圖1。EC9706細胞中Mcl-1的相對表達量為(37.8±2.0)%，高于Het-1細胞(12.6±1.0)%(t=19.289，P<0.001)。

圖1 Mcl-1在Het-1及EC9706細胞中的表達

2.2轉染Mcl-1siRNA后EC9706細胞中Mcl-1蛋白的表達Mcl-1的干擾效果見圖2，EC9706細胞中Mcl-1的表達為(117.57±5.17)%，高于轉染Mcl-1 siRNA的EC9706細胞(19.89±0.82)%，t=32.346，P<0.001。

2.3轉染Mcl-1siRNA的EC9706細胞經紫杉醇處理后增殖抑制率的變化結果見表1。

2.4轉染Mcl-1siRNA的EC9706細胞經紫杉醇處理后凋亡率的變化空白對照、經紫杉醇處理的EC9706細胞及轉染Mcl-1 siRNA并經紫杉醇處理的EC9706細胞凋亡率分別為(1.70±0.53)%、(18.70±0.65)%和(28.00±2.13)%，3組間差異有統計學意義(F=305.473，P<0.001)，組間兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

1、2：分別為未轉染和轉染Mcl-1 siRNA的EC9706細胞圖2 EC9706細胞中的Mcl-1的干擾效果

表1 轉染Mcl-1 siRNA的EC9706細胞經紫杉醇處理后增殖抑制率的變化(n=3)

F組間=73.201,P<0.001;F濃度=449.458,P<0.001;F交互=7.311,P=0.001；*：與未轉染Mcl-1 siRNA組相比，P<0.05

3 討論

紫杉醇是從紅豆杉科屬植物短葉紅豆杉中分離出的一種二萜烯類藥物。20世紀80年代中期，Horwitz首次揭示了紫杉醇的抗腫瘤機制主要為通過誘導和促進微管蛋白聚合，導致微管束排列異常，進而抑制細胞有絲分裂，使細胞停滯在G2/M期[5]。相繼有研究[6-9]發現紫杉醇可以用于治療頭頸部腫瘤、卵巢癌、肺癌等多種癌癥。

由線粒體引發的細胞內源性凋亡是腫瘤細胞經典的凋亡通路之一[10]。Bcl-2家族蛋白是控制細胞生存死亡的關鍵蛋白，其中抑制凋亡蛋白包括Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xl等，這些抑制凋亡蛋白一直是腫瘤分子靶向治療研究的熱點[11-12]。本研究證實Mcl-1蛋白在食管鱗癌EC9706細胞中高表達，因此靶向設計了siRNA干擾EC9706細胞中Mcl-1的表達。干擾Mcl-1基因后，在1.60至25.00 μmol/L紫杉醇作用下，EC9706細胞的增殖抑制率增加；而當紫杉醇濃度為50.00 μmol/L時，無論是否敲除Mcl-1都能抑制細胞增殖，主要原因可能為大劑量紫杉醇本身即可抑制腫瘤細胞增殖。此外，本研究還發現與單用紫杉醇相比，干擾Mcl-1基因后0.4 μmol/L紫杉醇即可使EC9706細胞凋亡率升高。

綜上所述，通過干擾抗凋亡基因Mcl-1可以抑制EC9706細胞增殖，促進細胞凋亡，增強EC9706細胞對紫杉醇的敏感性；實驗結果為提高食管鱗癌化療敏感性，改善臨床療效提供了新方法。

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