β-胡蘿卜素對食管鱗癌EC1細胞內活性氧和細胞凋亡的影響

劉艷霞，張璐玉，崔艷艷，張 樂，劉雯雯，黃團結，李 鵬，楊 璐，許 玲，植清雪，張彥婷，關方霞

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院 鄭州 450052

食管鱗癌在中國北部、日本、亞洲中部、南美洲的部分地區、非洲的東部和南部高發，是世界上第八大常見腫瘤[1]。已有研究[2-4]證實β-胡蘿卜素能夠有效預防或降低癌癥的發生，且可以從日常飲食中獲取。本課題組前期研究[5-7]表明，β-胡蘿卜素能夠從體內外水平有效抑制食管鱗癌的增殖、遷移，并促進其凋亡。有研究[8]表明，β-胡蘿卜素能夠通過調節胞內氧化還原水平發揮抗腫瘤作用。該研究通過探討β-胡蘿卜素對食管鱗癌細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導的線粒體凋亡通路的影響，揭示β-胡蘿卜素對食管鱗癌的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1主要材料EC1細胞由課題組前期凍存，β-胡蘿卜素購自美國Sigma公司， ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，線粒體膜電位檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Bax、Bcl-2、Capase-3一抗和二抗抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，β-actin抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，DMEM高糖培養基、磷酸鹽緩沖液、胰酶、細胞培養用青霉素鏈霉素混合液購自美國HyClone公司，胎牛血清購自以色列BI公司。EC1細胞在含有體積分數10%胎牛血清的高糖培養基、37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養，待細胞融合度達80%時，加入含2.5 g/L的胰蛋白酶消化液處理3 min左右，按13傳代，隔天換液，培養3代后用于后續實驗。

1.2β-胡蘿卜素的配制、細胞分組和處理在無菌超凈臺中避光條件下，取0.107 4 g β-胡蘿卜素溶解于2 mL四氫呋喃中，配制成終濃度為10 mmol/L的母液，且現用現配。將EC1細胞隨機分為對照組(含16 μL四氫呋喃)和30、50、80 μmol/L β-胡蘿卜素處理組(每組細胞均設3個復孔)，其中50 μmol/L約為β-胡蘿卜素對EC1細胞IC50值。EC1細胞長至對數生長期時將其消化、計數，接種于6孔板，每孔1 mL細胞懸液(約1.5×106個/mL)，搖晃混勻之后置于37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養12～18 h，棄去上清，加入不含血清的高糖培養基2 mL，然后將β-胡蘿卜素稀釋至相應的質量濃度處理EC1細胞48 h。

1.3各組細胞內線粒體膜電位的檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)檢測試劑盒(JC-1法)是以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體MMP變化。在MMP較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光；在MMP較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，可以產生綠色熒光。細胞分組及培養同1.2。根據南京建成生物工程研究所的試劑盒使用說明書進行實驗，隨后置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4各組細胞內ROS水平檢測細胞分組及培養同1.2。分別用不同濃度的β-胡蘿卜素處理EC1細胞48 h后，加入10 μmol/L DCFH-DA于培養基中，37 ℃孵育細胞1 h；孵育結束后用含2.5 g/L的胰蛋白酶溶液消化3 min，終止消化后離心收集細胞，用PBS洗1～2次，最后用PBS重懸；將重懸的細胞置于比色皿中放于熒光分光光度計測定并讀取吸光度(D)值。

1.5各組細胞中細胞色素C(Cyt-C)含量的ELISA檢測根據南京建成生物工程研究所提供的人Cyt-C酶聯免疫檢測試劑盒說明書操作，采用競爭法檢測樣本中Cyt-C的含量。細胞分組及培養同1.2。將96孔板置于450 nm處讀取D值，使用 ELISAcalc 進行計算，擬合模型選用logistic 曲線(四參數)。

1.6各組細胞凋亡的AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞分組及培養同1.2。分別用不同濃度的β-胡蘿卜素處理EC1細胞48 h后棄去上清，1×PBS洗2遍，用不含EDTA的胰蛋白酶消化3 min，終止消化后離心收集細胞，1×PBS洗2遍，計數，離心收集細胞，調節細胞濃度為1×106個/mL，取1 mL細胞懸液，離心棄上清，先加入100 μL Binding Buffer懸浮細胞，輕輕吹打均勻，加入5 μL Annexin V-FITC吹打均勻，加入5 μL Propidium Iodide吹打均勻，室溫避光放置15 min后，每個樣品再加入400 μL Binding Buffer，最終Binding Buffer的體積為500 μL，保證1 h內用流式細胞儀檢測。

1.7各組細胞中蛋白濃度的Westernblot檢測細胞分組及培養同1.2。分別用不同濃度的β-胡蘿卜素處理EC1細胞48 h后，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，應用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入2×SDS-PAGE Loading Buffer調節濃度一致后，放于金屬浴中95 ℃加熱10 min，置于-20 ℃保存。SDS-PAGE電泳進行蛋白質分離，電泳結束后濕轉，將膠轉至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉液封膜2 h，加一抗(β-actin按12 000稀釋，Bcl-2 按11 000稀釋，Bax按1500稀釋，Capase-3按1500稀釋)，4 ℃冰箱孵育過夜，第2天使其恢復至室溫之后1×TBST洗膜4次，10 min/次，室溫孵育二抗2 h，加山羊抗兔二抗(按12 000稀釋)，1×TBST洗膜4次，10 min/次，洗膜結束后置于曝光儀中進行ECL化學發光顯影成像，利用Image J 軟件進行條帶灰度分析。

1.8統計學處理采用SPSS 21.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗分析β-胡蘿卜素對EC1細胞內ROS水平、MMP、Cyt-C和細胞凋亡的影響以及對EC1細胞內Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1β-胡蘿卜素對EC1細胞內ROS水平、MMP、Cyt-C含量和細胞凋亡的影響見表1、圖1。由表1可知，不同濃度的β-胡蘿卜素分別處理EC1細胞48 h后，與對照組相比，β-胡蘿卜素處理組細胞內ROS水平、Cyt-C含量和細胞凋亡率明顯升高。

2.2β-胡蘿卜素對EC1細胞內Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響結果見表2、圖2。

表1β-胡蘿卜素對EC1細胞內ROS水平、MMP、Cyt-C含量和細胞凋亡的影響(n=3)

組別ROS水平MMPCyt-C含量細胞凋亡率/%對照組3.666±0.3780.540±0.050178.25±14.521.80±0.80 30 μmol/Lβ-胡蘿卜素組4.266±0.2510.630±0.024183.51±12.433.20±0.60 50 μmol/L β-胡蘿卜素組5.400±0.360?0.863±0.051?204.67±21.17?9.70±1.00? 80 μmol/L β-胡蘿卜素組6.133±0.305?1.070±0.113?230.91±13.93?15.50±1.00? F34.32032.3806.826159.700 P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：與對照組相比，P<0.05

1：對照組；2：30 μmol/L β-胡蘿卜素組；3：50 μmol/L β-胡蘿卜素組；4：80 μmol/L β-胡蘿卜素組圖1 β-胡蘿卜素處理EC1細胞后MMP的變化

表2 β-胡蘿卜素對EC1細胞內Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響(n=3)

*：與對照組相比，P<0.05

1：對照組；2：30 μmol/L β-胡蘿卜素組；3：50 μmol/L β-胡蘿卜素組；4：80 μmol/L β-胡蘿卜素組圖2 β-胡蘿卜素對EC1細胞內Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響

3 討論

在植物中β-胡蘿卜素含量十分豐富，且被體內吸收后轉化為維生素A，即視黃醇。Huang等[9]研究發現，人體代謝產物中血清視黃醇濃度與患前列腺癌的風險呈正相關。Vieira等[10]研究發現，膳食中經常補充含有胡蘿卜素或β-胡蘿卜素的食物可以降低患肺癌的風險。研究[5,11-14]表明，β-胡蘿卜素能夠有效抑制多種腫瘤的增殖，發揮抗腫瘤作用，然而其作用機制尚未完全揭示。已有研究[15-17]證實β-胡蘿卜素能夠通過調控NF-κB通路、PI3K/AKT通路或pRB通路等信號通路發揮抗腫瘤作用；Sowmya等[18]研究發現β-胡蘿卜素可通過NF-κB通路誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡，抑制其增殖。此外，β-胡蘿卜素能夠通過調節胞內氧化還原水平發揮抗腫瘤作用：Park等[8]研究發現，β-胡蘿卜素能夠通過影響線粒體內的ROS水平來誘導胃癌AGS細胞凋亡。

細胞凋亡主要包括兩種途徑：外源性受體凋亡途徑和內源性線粒體凋亡途徑[19]。ROS是線粒體在有氧呼吸過程中代謝產生的一系列活性氧簇，能夠通過細胞氧化應激水平來誘導細胞凋亡，并能夠影響細胞信號轉導途徑來調控腫瘤細胞的凋亡及增殖[18]。低水平的ROS是細胞正常增殖和分化的生理調節因子，然而，過量的ROS積累會破壞呼吸鏈，抑制線粒體電子傳遞鏈，從而導致線粒體通透性的改變和MMP的丟失，Cyt-C從線粒體釋放到細胞質中；最后，Caspase級聯系統被激活，從而誘導腫瘤細胞凋亡[20-21]。近年來研究[22]表明，許多靶向ROS代謝的抗腫瘤化合物可誘導腫瘤細胞凋亡，并可能發展成為潛在的抗腫瘤藥物。研究[23]表明，在低濃度時，β-胡蘿卜素可以作為抗氧化劑，抑制自由基的產生；而在較高濃度時，則可以作為促氧化劑，增加胞內自由基的形成并誘導細胞凋亡的發生。在人白血病T細胞系Molt 4細胞中，β-胡蘿卜素能夠增加細胞內ROS水平，使胱天蛋白酶活化，誘導細胞凋亡的發生[24]

本研究發現，β-胡蘿卜素處理EC1細胞后，能夠引起胞內ROS含量的增加，降低MMP，觸發Cyt-C的釋放，進一步誘導凋亡蛋白Bax表達降低，Bcl-2、Casepase-3蛋白表達增加，從而促使細胞發生凋亡，說明ROS在Caspase活化和細胞凋亡的起始和執行階段起著重要作用，β-胡蘿卜素能夠通過調節ROS水平發揮其對食管鱗癌細胞的抗腫瘤作用。

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