MG53蛋白對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷的影響

李 鵬，馬珊珊，黃團(tuán)結(jié)，劉雯雯，許 玲，劉艷霞，劉騰飛，周建康，楊 波，關(guān)方霞

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院病理科 鄭州 450047 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

HT22是一種永生化的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞,具有典型的神經(jīng)元形態(tài)及特征,被廣泛應(yīng)用于研究神經(jīng)元的損傷以及神經(jīng)退行性疾病[1]。在創(chuàng)傷性腦損傷、燒傷等疾病中，患者往往會并發(fā)內(nèi)毒素血癥，創(chuàng)面和體內(nèi)存在大量內(nèi)毒素，影響神經(jīng)細(xì)胞的存活和增殖。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是一種內(nèi)毒素，能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子和趨化因子，引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致多種器官的損傷[2]。MG53蛋白是TRIM家族蛋白成員之一[3]，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生損傷后可快速定位到損傷部位，進(jìn)行細(xì)胞膜的修復(fù)。本課題組前期研究[4]結(jié)果顯示，MG53蛋白對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。因此，本實驗擬用LPS誘導(dǎo)HT22細(xì)胞建立神經(jīng)元氧化損傷模型，進(jìn)而觀察MG53蛋白對HT22細(xì)胞是否有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22購自北京歐林格生物科技有限公司，MG53蛋白由美國俄亥俄州立大學(xué)麻建杰教授贈送，LPS購自美國Sigma-Aldrich公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素鏈霉素混合液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gemini公司，CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)測試盒和丙二醛(MDA)測試盒購自南京建成生物公司，β-actin、Bcl-2、Bax和Cyclin D1多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)HT22細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素)中，放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿25T培養(yǎng)瓶底80%左右時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化液處理1 min左右，按13傳代，隔天換液，取培養(yǎng)3代以后的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3LPS對HT22細(xì)胞作用濃度和時間的篩選取對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL(密度為5×104mL-1)細(xì)胞懸液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)16～18 h，細(xì)胞貼壁后棄上清,加入用完全培養(yǎng)基配制的LPS(LPS終濃度分別為25、50、100、250、500、1 000、1 500 mg/L)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、60 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度，計算細(xì)胞增殖抑制率。每個濃度組設(shè)置3個復(fù)孔。細(xì)胞存活率=(實驗組吸光度-空白吸光度)/(對照吸光度-空白吸光度)×100%。細(xì)胞增殖抑制率=1-細(xì)胞存活率。

1.4實驗分組取對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞, 分4組培養(yǎng)。NC組正常培養(yǎng)，模型組培養(yǎng)液中加入500 mg/L LPS，MG53組培養(yǎng)液中加入30 mg/L MG53，MG53+模型組培養(yǎng)液中同時添加30 mg/L MG53和500 mg/L LPS。

1.5觀測指標(biāo)

1.5.1 細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞接種于96孔板，按1.4分組處理48 h后， CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5.2 細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng),待細(xì)胞融合度達(dá)到60%以上時，按1.4分組處理48 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集后用PBS洗2遍，取5×105個細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮，然后加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL Propidium Iodide混勻,室溫、避光反應(yīng) 5～15 min， 1 h以內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5.3 細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞接種于6孔板，按1.4分組處理48 h。離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，取1 mL細(xì)胞懸液，PBS洗2遍，離心去上清，在沉淀中加入體積分?jǐn)?shù)為70%預(yù)冷乙醇500 μL固定，4 ℃過夜。用PBS洗去固定液，加100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min，最后上流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5.4 細(xì)胞遷移距離 鋪板前在6孔板底部均勻劃橫線，每孔5條，然后板中培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%以上時，用槍頭垂直底部劃橫線，PBS清洗3遍，在顯微鏡下拍照記錄原始劃痕，然后按1.4分組處理48 h后，在顯微鏡下再次拍照記錄，用Image J軟件分析遷移距離(單位為μm)。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5.5 細(xì)胞內(nèi)SOD活性 將HT22細(xì)胞接種于96孔板，按1.4分組處理48 h。離心收集細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度1×106mL-1，超聲破碎，用微量分光光度計測量蛋白濃度，按SOD測試盒說明書操作，檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5.6 細(xì)胞內(nèi)MDA含量 將HT22細(xì)胞接種于96孔板，按1.4分組處理48 h。按MDA測試盒說明書操作，檢測細(xì)胞內(nèi)MDA含量。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5.7 Bcl-2、Bax和CyclinD1蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，按1.4分組處理48 h。收集細(xì)胞，提取蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉液封閉2 h，加一抗(β-actin按12 000、Bcl-2 按11 000、Bax按1500、Cyclin D1按12 000稀釋) 4 ℃孵育過夜，TBST洗膜 3 次，加二抗(山羊抗兔HRP，12 000稀釋) 室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，隨后ECL化學(xué)發(fā)光顯影成像，利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)。不同濃度LPS作用不同時間后HT22細(xì)胞增殖抑制率的比較采用5×7析因設(shè)計的方差分析；4組細(xì)胞存活率、凋亡率、細(xì)胞周期、遷移距離、細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量，以及Bcl-2、Bax和Cyclin D1蛋白表達(dá)的比較采用2×2析因設(shè)計的方差分析；檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1LPS作用濃度和時間的確定不同質(zhì)量濃度LPS作用不同時間后HT22細(xì)胞增殖抑制率的比較見表1。由表1可知，低濃度(25、50、100、250 mg/L)LPS促進(jìn)細(xì)胞增殖，高濃度LPS抑制細(xì)胞增殖。其中500 mg/L LPS作用于HT22細(xì)胞48 h，細(xì)胞增殖抑制率接近50%，因此選擇該作用條件用于后續(xù)實驗。

表1 不同質(zhì)量濃度LPS作用不同時間后HT22細(xì)胞增殖抑制率的比較(n=3) %

F濃度=1 878.000，F(xiàn)時間=206.800，F(xiàn)交互=30.760，P均<0.001。

2.2MG53對LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活、凋亡和遷移能力的影響4組細(xì)胞存活率、凋亡率和遷移距離的比較見圖1、表2。該結(jié)果說明LPS可降低HT22細(xì)胞存活率，提高其凋亡率，降低其遷移能力；MG53預(yù)處理可以在一定程度上拮抗LPS對HT22細(xì)胞的增殖抑制作用，提高HT22細(xì)胞的遷移能力。

2.3MG53對LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞周期的影響

結(jié)果見表3。這一結(jié)果說明LPS可阻止HT22細(xì)胞由G0/G1期向S期運轉(zhuǎn)；而MG53有助于促進(jìn)HT22細(xì)胞周期從G0/G1期向S期運轉(zhuǎn)。

2.4MG53對LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響結(jié)果見表4。這一結(jié)果說明LPS可誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，而MG53能夠提高HT22細(xì)胞的抗氧化能力。

2.5MG53對LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和CyclinD1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖2、表5。該結(jié)果說明LPS可誘導(dǎo)HT22細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，同時降低周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達(dá)；而MG53可促進(jìn)HT22細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)。

圖1 劃痕實驗

表2 4組細(xì)胞存活率、凋亡率和遷移距離的比較

表3 4組細(xì)胞周期的比較 %

表4 4組細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量的比較

圖2 Bax、Bcl-2和Cyclin D1蛋白的表達(dá)

表5 4組Bcl-2、Bax和Cyclin D1蛋白表達(dá)的比較

3 討論

目前，以LPS為應(yīng)激源誘導(dǎo)的氧化損傷模型有很多，如LPS誘導(dǎo)的大鼠肝損傷[5]、LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞氧化損傷[6]和LPS誘導(dǎo)的小鼠急性腦損傷[7]模型等，但關(guān)于建立LPS誘導(dǎo)HT22細(xì)胞氧化損傷模型的研究較少。氧化損傷細(xì)胞模型建立的關(guān)鍵在于細(xì)胞存活率的控制。本實驗發(fā)現(xiàn)HT22細(xì)胞具有較強(qiáng)的內(nèi)毒素耐受性，LPS作用濃度大于250 mg/L才會對其產(chǎn)生明顯的毒素作用；500 mg/L的LPS作用HT22細(xì)胞48 h，細(xì)胞增殖抑制率接近50%，因此本實驗選用500 mg/L LPS處理48 h建立HT22氧化損傷模型。

研究[8-9]發(fā)現(xiàn)MG53在細(xì)胞膜損傷和組織損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，對肺、腎臟、腦等組織損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用[10-11]。同時MG53對肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及干細(xì)胞等也具有損傷保護(hù)作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，MG53能夠增強(qiáng)HT22細(xì)胞的增殖和遷移能力，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1期向S期運轉(zhuǎn)，提高周期蛋白Cyclin D1表達(dá)，增強(qiáng)HT22細(xì)胞的抗氧化能力。LPS誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷后，細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)量增加，Bcl-2表達(dá)量下降；而MG53蛋白干預(yù)可減少HT22的凋亡，增加Bcl-2的表達(dá)并降低Bax的表達(dá)。

綜上所述，MG53能夠減輕LPS誘導(dǎo)的HT22氧化損傷，這為MG53蛋白應(yīng)用于神經(jīng)性損傷的保護(hù)和修復(fù)提供了理論依據(jù)。

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