新基因AY358935對B16細胞小鼠體內外生長的影響

熊紹權，蔡 蕊，李亞玲，王莉娟，羅秋月，宋婷婷，丁 倩，李世杰，何成詩

1)成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腫瘤科 成都 610075 2)成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院呼吸科 成都 610075

AY358935是本課題組利用交叉免疫學篩選獲得的一個功能未知的新基因，相對分子質量為10 100，位于人類染色體11q12.3，包含2個外顯子和1個內含子，由93個氨基酸組成，N末端含有一個由23個氨基酸殘基組成的信號肽和一個短的跨膜片段，預測為小分子分泌蛋白[1]。前期生物信息學分析[2]發(fā)現(xiàn)，AY358935在癌組織中普遍表達，提示該基因可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有關該基因的確切功能，目前國內外尚未見有文獻報道。本研究首先構建了穩(wěn)定轉染小鼠AY358935(mAY358935)的B16細胞(B16-mAY)，觀察該細胞的體外增殖活性和小鼠體內成瘤情況，并檢測B16-mAY細胞培養(yǎng)上清對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)生長的影響，探討其與腫瘤的可能關系，報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑pCMV-Myc-mAY重組質粒由趙新宇博士友贈；兔抗人AY358935多克隆抗體由本實驗室自制[2-3]。pcDNA3.1質粒、脂質體lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。MTT、DMSO購自美國Alnreseo公司。DAB顯色試劑盒購自美國Vector Laboratory公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗和兔抗人β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。BamHⅠ/XhoⅠ購自TaKaRa公司。G418、胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基原粉購自美國Gibco公司。明膠由邁新生物制劑有限公司提供。

1.2細胞模型B16-mAY的建立

1.2.1 AY358935真核表達質粒的構建 pCMV-Myc-mAY重組質粒的MCS位點克隆有mAY388935的完整cDNA編碼區(qū)序列。以pCMV-Myc-mAY為模板進行PCR擴增，引物序列：上游5’-CGGGATC CATGGAGGTGGCTCGTA-3’，下游：5’-CCGCTCGAG TCATGCTGACCTGCCA-3’，退火溫度60 ℃，循環(huán)35次。用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1空載體并連接，構建真核表達質粒pcDNA3.1-mAY，重組質粒經(jīng)雙酶切和DNA測序鑒定。引物合成和DNA測序由上海英杰生物技術公司完成。

1.2.2 細胞轉染及篩選、鑒定 B16細胞(購自美國ATCC)用DMEM(含體積分數(shù)10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L 鏈霉素)于體積分數(shù)5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的細胞接種到6孔板，待細胞長至60%～70%時，用脂質體lipofectamine2000包裹pcDNA3.1-mAY進行轉染，脂質體與質粒比例為2.5 μL1 μg。轉染72 h后，換完全培養(yǎng)基并添加G418，篩選穩(wěn)定轉染株。傳代培養(yǎng)2次，提取1×106個細胞的總蛋白，Western blot法檢測mAY358935蛋白表達情況，蛋白表達良好者即為B16-mAY細胞，然后保種備用。G418篩選濃度為400 mg/L，維持濃度為200 mg/L。以pcDNA3.1空質粒轉染細胞(B16-pcDNA3.1)和未轉染細胞(B16)作對照。

1.3B16-mAY細胞體外增殖活性的觀察采用MTT法檢測細胞體外生長情況。將成指數(shù)期生長的B16-mAY、B16-pcDNA3.1以及B16細胞接種到96孔板培養(yǎng)，每孔2 000～3 000個細胞，每種細胞5個復孔，用200 μL DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)。96孔板提前2 h用10 g/L明膠處理。從第2天開始，每天每孔加入20 μL MTT (5 g/L)孵育4 h，棄凈培養(yǎng)基后，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度(A)，以此表示細胞增殖活性。連續(xù)測定6 d，每天測定1次，第3天換一次培養(yǎng)液。實驗獨立重復3次。以時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。

1.4B16-mAY細胞在小鼠體內成瘤情況的觀察將成指數(shù)期生長的B16-mAY和B16-pcDNA3.1細胞用胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心3 min后棄上清，用雙無DMEM重懸細胞，洗凈胰蛋白酶，再次離心，細胞沉淀用雙無DMEM重懸，調整細胞密度為5×107mL-1。參照文獻[4-5]，選取6～8周齡的C57/BL6小鼠24只(雌雄各半，每只體重18～22 g，SPF級別，由四川大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK<川>-09-2006)，隨機分為兩組，每組12只，每只腹背皮下注射100 μL的B16-mAY或B16-pcDNA3.1細胞懸液。從第8天開始，用游標卡尺測量皮下腫瘤的長徑和寬徑，每隔1 d測量一次，直到有小鼠因腫瘤生長而出現(xiàn)死亡。參照文獻[6-8]計算：腫瘤體積=0.52×長徑×寬徑2。斷頸處死小鼠，取出瘤體，用中性福爾馬林固定24 h，石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察。

1.5B16-mAY細胞培養(yǎng)上清對HUVEC生長的影響①將B16-mAY和B16-pcDNA3.1細胞于體積分數(shù)5% CO2、37 ℃孵箱中用DMEM培養(yǎng)，當細胞生長狀態(tài)良好至70%～80%單層匯合時，換新鮮DMEM 10 mL培養(yǎng)，24 h后收集培養(yǎng)上清，分別命名為mAY上清和pcDNA3.1上清，4 ℃存放，2周內使用。將mAY上清用pcDNA3.1上清進行11、13稀釋，分別得1/2mAY上清、1/4mAY上清。②臨床采集臍帶，參照文獻[9-10]報道的規(guī)范方法分離HUVEC并培養(yǎng)5～7 d，細胞長滿至80%～90%單層匯合時傳代，取傳2～4代的細胞用于實驗[11]。將HUVEC細胞接種到96孔板，每孔1 000～2 000個，用100 μL DMEM(不含bFGF)于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)。96孔板提前2 h用10 g/L明膠處理。接種細胞第2天，換用制備好的上清(pcDNA3.1上清、1/2mAY上清、1/4mAY上清、mAY上清)繼續(xù)培養(yǎng)，每組5個復孔，每孔加上清100 μL，48 h后分別更換相同上清100 μL。分離接種細胞第5天，MTT法測HUVEC增殖活性，方法同前。實驗獨立重復3次。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。3組細胞mAY358935蛋白表達水平、增殖活性的比較采用單因素方差分析；B16-pcDNA3.1和B16-mAY細胞移植瘤體積的比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析；4組HUVEC增殖活性的比較采用單因素方差分析；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1B16-mAY細胞的鑒定pcDNA3.1-mAY經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后，產(chǎn)物大小280 bp，與mAY358935 ORF相符，見圖1，測序結果提示正確。Western blot結果見圖2，B16-mAY、B16-pcDNA3.1和B16細胞中mAY358935蛋白相對表達水平分別為(90.4±9.2)%、(39.6±3.9)%和(44.3±4.2)%,3組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=5.440,P=0.043)，B16-mAY細胞中mAY358935蛋白相對表達水平最高(P<0.05)，表明穩(wěn)定轉染mAY358935的細胞模型成功建立。

1:pcDNA3.1-mAY;2:pcDNA3.1-mAY酶切片段;M：DNA marker圖1 pcDNA3.1-mAY的酶切鑒定

1:B16-mAY細胞;2:B16-pcDNA3.1細胞;3:B16細胞圖2 3組細胞mAY358935蛋白的表達

2.2B16-mAY細胞的體外增殖活性B16-mAY、B16-pcDNA3.1和B16細胞的增殖曲線見圖3。B16-mAY細胞體外生長良好。尤其在第6天時，B16-mAY、B16-pcDNA3.1和B16細胞組的吸光度值分別為(0.95±0.15)、(0.75±0.05)和(0.68±0.04)，3組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=10.431,P=0.022)，B16-mAY組明顯高于其他兩組(P<0.05)。

圖3 3組細胞的增殖曲線

2.3B16-mAY細胞在小鼠體內的成瘤情況

2.3.1 腫瘤生長情況 兩組小鼠移植瘤體積見表1。B16-mAY組移植瘤體積大于B16-pcDNA3.1組。

表1 各組移植瘤體積比較 cm3

F組別=6 647.359，F(xiàn)時間=549.615，F(xiàn)交互=437.975，P<0.001

2.3.2 腫瘤組織學表現(xiàn) HE染色結果見圖4，B16-mAY組移植瘤組織壞死區(qū)域明顯較大；壞死腫瘤組織之間，特別是中心區(qū)域，出現(xiàn)島狀成活的腫瘤細胞，圍繞腫瘤血管呈袖套樣排列。B16-pcDNA3.1移植瘤組織相對壞死區(qū)域較少，且細胞壞死區(qū)域未發(fā)現(xiàn)存活細胞。

A1、B1：B16-pcDNA3.1(HE，×100)；A2、B2、C2：B16-mAY(HE，×100)；C1：C2圖中放大區(qū)域(HE，×400)圖4 B16-pcDNA3.1和B16-mAY細胞移植瘤組織學表現(xiàn)

2.4mAY上清對HUVEC增殖的影響pcDNA3.1、1/4mAY、1/2mAY和mAY上清組HUVEC的增殖活性分別為(0.36±0.06)、(0.43±0.08)、(0.61±0.09)和(0.89±0.10)，4組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=7.958，P=0.035)。1/4mAY上清即可促進HUVEC增殖，1/2mAY和mAY上清促HUVEC增殖的作用更強(P<0.05)。

3 討論

本研究利用pcDNA3.1-mAY穩(wěn)定轉染B16細胞，建立穩(wěn)定表達AY358935的B16-mAY細胞模型。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，B16-mAY細胞體外增殖活性明顯高于B16-pcDNA3.1及B16細胞，提示AY358935可促進腫瘤細胞的體外生長。接著，我們將B16-mAY細胞接種到小鼠皮下觀察成瘤情況，結果顯示，B16-mAY接種組移植瘤的生長快于B16-pcDNA3.1接種組。進一步對腫瘤組織進行HE染色觀察，結果顯示，B16-pcDNA3.1組移植瘤組織壞死區(qū)域相對較小，屬于中心性壞死，壞死區(qū)域中間沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤血管和存活細胞；而B16-mAY接種組移植瘤組織中出現(xiàn)較多大面積壞死，但壞死區(qū)域并非完全呈中心性，壞死區(qū)域中間可見散在的存活細胞，圍繞腫瘤血管排列成袖套狀。這提示AY358935可能促進了血管生長，進而有利于腫瘤細胞的存活和增殖。雖然我們多次對移植瘤組織進行CD31和CD34免疫組化染色，但顯色結果不盡如人意，分析可能原因有黑色素的干擾，或者抗原性弱化，或者由于惡性黑色素瘤常以血管擬態(tài)形成等[12-13]。

為進一步探索mAY358935的促血管生長活性，本研究用不同稀釋倍數(shù)的B16-mAY培養(yǎng)上清培養(yǎng)HUVEC，結果顯示，稀釋2倍后的B16-mAY培養(yǎng)上清即可促進HUVEC的生長，完全B16-mAY培養(yǎng)上清的作用則更加明顯，這表明mAY358935基因具有促進血管內皮生長的作用。血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，當腫瘤體積大于1 mm3時，其增長依賴新生血管供養(yǎng)供給[14-18]，因而抗血管治療成為近年來腫瘤治療的重要策略之一[19]。本研究結果顯示，AY358935基因具有促進血管內皮生長的作用，有可能成為抗血管治療的重要靶點。

綜上所述，本研究結果顯示，AY358935基因具有促進腫瘤生長、促進血管生長的作用，可能是一個潛在的抗腫瘤干預靶點。

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