恒河猴卵巢組織中年齡相關性差異基因的生物信息學分析

冀萌萌，譚雪梅，余凱倫，張秀麗，王宗立，陶宇昌，劉蔓蔓，高 湛，劉小轉，余增麗

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001 2)鄭州市第二人民醫院檢驗科 鄭州 450006 3)鄭州大學第五附屬醫院婦產科 鄭州 450052 4)河南省人民醫院科研與學科建設部 鄭州 450003

目前，由于社會環境、生活壓力以及“二胎”生育政策放開的影響，我國女性的生育年齡越來越晚[1]。但隨著年齡的增長，女性的生育能力逐漸下降。因此探索卵巢衰老的病理生理過程和發生機制，并在此基礎上找出延緩卵巢衰老的干預靶點，有重要意義。卵巢衰老主要表現為卵泡數量和質量的下降，年齡是最重要的影響因素[2-3]。人類原始卵泡池形成于胎兒期，在孕期20周時達到高峰，然后急劇減少，近青春期時，卵巢內原始卵泡僅剩40萬個[4-5]。女性在50歲閉經時，卵巢中僅剩下大約1 000個原始卵泡[4,6]。目前，控制原始卵泡存活和喪失平衡的分子機制還不太明確。研究[7-10]表明，在卵泡發育過程中，大量mRNA和蛋白儲存于卵母細胞內并被其利用，而卵母細胞轉錄活性的調節主宰著其對發育能力的最終獲得。有研究[11-12]表明，年輕與老年女性之間決定卵母細胞生物功能的關鍵基因的轉錄水平存在差異，有可能與卵巢老化有關。

本研究通過分析基因表達譜芯片數據集GSE44533，鑒別不同年齡段的恒河猴卵巢樣本中差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)，然后對DEGs進行GO富集、KEGG通路分析及蛋白質-蛋白質作用網絡(protein-protein interaction, PPI)分析，探索卵巢組織中潛在的受年齡影響的生物標志物和信號通路。

1 材料與方法

1.1材料GSE44533數據集來源于美國國家生物信息中心的GSE數據庫，該數據集包含了由GPL3535芯片平臺采集的9個恒河猴卵巢樣品的基因芯片表達譜數據，分為老、中、青3個年齡組，每組3個樣品。其中，老年組恒河猴年齡18～19歲，已經喪失生育能力；中年組年齡7～8歲，為最佳生育期；青年組年齡3～4歲，具有正常規律的動情周期；均未繁殖過。按照中、青年恒河猴的動情周期記錄，均于動情前期處死并采集卵巢。

1.2數據處理及DEGs的篩選首先，利用SAS 9.2 及RNA Express軟件對GSE44533數據集進行預處理、背景矯正、數據標準化等。將探針與從Affymetrix官方網站(http://www.affymetrix.com)下載的注釋文件進行匹配，得到包含官方基因符號的基因表達譜數據集；在Morpheus網絡平臺(https://sofeware.brodinstitute.org/morpheus/)，根據信噪比≥4或者≤-4，篩選出DEGs。

1.3DEGs的功能富集分析采用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在線對篩選出的DEGs進行功能富集分析，預設條件為ease score≤0.1 和 thresholds account≥2。功能富集分析主要包括GO功能分析和KEGG通路富集分析。

1.4DEGs的調控網絡分析STRING(http://string-db.org/)是用于檢索分子交互作用的搜索工具，旨在評估蛋白質-蛋白質相互作用的關系。新版本STRING10.5涵蓋了來自于2 031個生物體的960萬個蛋白質。本研究中，設置組合分數(combined score)>0.4過濾PPI數據，利用STRING檢索DEGs中的交互基因，然后應用Cytoscape 3.5.1軟件中的MCODE，按照預設條件(理發模式，節點評分截止值為0.2，K核心值為2)進行重塑，構建調控網絡模塊。

2 結果

2.1DEGs的篩選青年組與中年組卵巢基因表達譜比較，共有253個DEGs，其中123個基因表達上調，130個基因表達下調；中年組與老年組比較，共有68個DEGs，其中50個基因表達上調，18個基因表達下調；青年組與老年組比較，共有636個DEGs，其中460個基因表達上調，176個基因表達下調。

2.2DEGs的功能富集青年組與中年組、中年組與老年組、青年組與老年組DEGs的GO分析結果見表1～3，表內Count(%)為對應GO的DEGs數目(對應GO的DEGs數目/能夠對應到GO數據庫中同類型的DEGs數目×100%)；KEGG通路富集結果見表4，其中Count(%)為對應pathway富集基因數目(對應pathway富集基因數目/能夠對應到pathway數據庫中的DEGs數目×100%)。GO功能分析時，從細胞組分、分子功能和生物過程3個方面展開。結果表明，3組DEGs在全細胞和細胞外區域廣泛分布，涉及氧化應激、DNA復制、修復和甲基化等方面。青年組與老年組的DEGs參與的生物過程主要有DNA結構與轉錄調控、DNA甲基化過程等；中年組與老年組的DEGs涉及的信號通路有卵母細胞減數分裂，涉及的基因為FBXO43、AURKA、PPP2R5E；而青年組與老年組的DEGs涉及丙酮酸代謝通路等。

表1 青年組與中年組的DEGs的GO分析

表2 中年組與老年組的DEGs的GO分析

表3 青年組與老年組的DEGs的GO分析

續表3

表4 3組DEGs的KEGG分析

2.3DEGs的調控網絡PPI分析結果顯示，僅青年組與老年組DEGs的模塊M1(score=6，node=6，edges=15)和M2(score=4，node=4，edges=6)符合條件,其中，M1包含6個基因(SNRNP200、DDX46、SNRNP35、DAZ2、ELAVL2、RBM46，見圖1、2)，M2包含4個基因(AURKa、EHMT2、AURKC、LOC715011)。

圖1 青年組與老年組DEGs的PPI

圖2 M1模塊

3 討論

隨著年齡增長，卵巢逐漸老化，而卵巢衰老主要表現為卵泡數量和質量的逐漸下降，導致女性生育能力下降甚至不育。而原始卵泡被招募到生長卵泡池中進行后續的發育[4,13]，卵母細胞凋亡導致的原始卵泡丟失等[14]，均決定了卵巢老化的進程[4-5,15]。在這些過程中，不同年齡階段的卵巢組織中基因表達譜可能存在差異，影響卵巢卵泡的數量及質量。本研究證實，青年組、中年組、老年組恒河猴卵巢組織中的基因表達譜存在差異。其中青年組與中年組之間有253個DEGs，中年組與老年組之間有68個DEGs，而青年組與老年組之間有636個DEGs。根據GO功能分析及KEGG通路富集分析結果，這些DEGs部分涉及卵母細胞減數分裂、丙酮酸代謝通路等。

在青年組與老年組DEGs的PPI分析中，模塊M1包含6個基因,分別為SNRNP200、DDX46、SNRNP35、DAZ2、ELAVL2、RBM46，這6個基因存在細胞分子交互作用。其中ELAVL2最初被描述為神經元蛋白，但是有研究[16]表明在保守表達的卵母細胞中ELAVL2轉錄水平比體細胞更豐富，其與卵母細胞的發育到底有何聯系，值得探索。RBM46(RNA結合基序蛋白46)轉錄后調控β-連環蛋白mRNA的降解，通過Wnt/β-聯蛋白途徑在胚胎干細胞分化調節中起重要作用[17]。DAZ2是精子發生相關蛋白，其在卵巢組織中出現異常表達，提示其可能對卵泡發育有關鍵調節作用，并且該調節與排卵后的精卵結合有關，當然，其在雌性生殖發育中的作用有待進一步研究。DDX46屬于RNA解旋酶的DEAD盒系列，其涉及二級RNA結構的調節[18]，在復雜的器官發育中起重要作用。SNRNP35和SNRNP200均屬于剪接因子。目前關于SNRNP200的研究較多關注的是其基因拷貝數突變與視網膜色素變性的關系[19-20]；關于SNRNP35的研究很少見，其可能是新發現的與卵巢發育有關的基因。

本研究雖然找出了不同年齡段恒河猴卵巢組織中部分基因表達的變化規律，但目前進行的數據分析工作還比較初步，今后還需要對篩選出來的關鍵基因進行各種實驗驗證，以探索其在卵巢卵泡發育過程中的作用，闡明卵巢衰老的病理生理過程和發生機制。

[1] LERIDON H.Demographic effects of the introduction of steroid contraception in developed countries[J].Hum Reprod Update,2006,12(5):603

[2] WILCOX AJ, WEINBERG CR, BAIRD DD.Post-ovulatory ageing of the human oocyte and embryo failure[J].Hum Reprod,1998,13(2):394

[3] ALVIGGI C,HUMAIDAN P,HOWLES CM,et al.Biological versus chronological ovarian age: implications for assisted reproductive technology[J].Reprod Biol Endocrinol,2009,7:101

[4] HANSEN KR,KNOWLTON NS,THYER AC,et al.A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause[J].Hum Reprod,2008,23(3):699

[5] BROEKMANS FJ,KNAUFF EA, TE VELDE ER,et al.Female reproductive ageing: current knowledge and future trends[J].Trends Endocrinol metab,2007,18(2):58

[6] SKINNER MK.Regulation of primordial follicle assembly and development[J].Hum Reprod Update,2005,11(5): 461

[7] GANDOLFI T,GANDOLFI F.The maternal legacy to the embryo:cytoplasmic components and their effects on early development[J].Theriogenology,2001,55(6):1255

[8] GOSDEN RG.Oogenesis as a foundation for embryo genesis[J].Mol Cell Endocrinol,2002,186(2):149

[9] SONG JL,WESSEL GM.How to make an egg:transcriptional regulation in oocytes[J].Differentiation,2005,73(1):1

[10]STITZEL ML,SEYDOUX G.Regulation of the oocyte-to-zygote transition[J].Science,2007,316(5823):407

[11]GR?NDAHL ML, YDING ANDERSEN C, BOGSTAD J,et al.Gene expression profiles of single human mature oocytes in relation to age[J].Human Reprod,2010,25(4):957

[12]AL-EDANI T,ASSOU S,FERRIRES A,et al.Female aging alters expression of human cumulus cells genes that are essential for oocyte quality[J].Biomed Res Int,2014,2014:964614

[13]HIRSHFIELD AN.Development of follicles in the mammalian ovary[J].Int Rev Cytol,1991,124:43

[14]MORITA Y,TILLY JL.Oocyte apoptosis:like sand through an hourglass[J].Dev Biol,1999,213(1):1

[15]FADDY MJ,GOSDEN RG.A model conforming the decline in follicle numbers to the age of menopause in women[J].Hum Reprod,1996,11(7):1484

[16]CHALUPNIKOVA K,SOLC P,SULIMENKO V,et al.An oocyte-specific ELAVL2 isoform is a translational repressor ablated from meiotically competent antral oocytes[J].Cell Cycle,2014,13(7):1187

[17]ZHAI L,WANG CC,CHEN YF,et al.Rbm46 regulates mouse embryonic stem cell differentiation by targeting beta-Catenin mRNA for degradation[J].PLoS One,2017,12(2):e0172420

[18]LI M,MA YC,HUANG P,et al.Lentiviral DDX46 knockdown inhibits growth and induces apoptosis in human colorectal cancer cells[J].Gene,2015,560(2):237

[19]EZQUERRA-INCHAUSTI M,BARANDIKA O,ANASAGASTI A,et al.High prevalence of mutations affecting the splicing process in a Spanish cohort with autosomal dominant retinitis pigmentosa[J].Sci Rep,2017,7:39652