雷公藤紅素對HGC-27細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響

王 紅，吳夢瑤，王秋寧，張 欣，李 紅

1)錦州醫(yī)科大學(xué)生化教研室 遼寧錦州 121000 2)錦州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室 遼寧錦州 121000 3)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科 遼寧錦州 121000

胃癌是人類容易罹患的第五大惡性腫瘤。我國胃癌每年新發(fā)病例近50萬，約占全球的50%，且發(fā)病率和病死率呈上升趨勢的同時，發(fā)病人群趨向年輕化[1-2]。目前，胃癌的治療以外科手術(shù)為主[3]，診治水平雖不斷提高，但部分患者術(shù)后效果欠佳，且一些胃癌晚期失去手術(shù)機(jī)會的患者缺乏有效的治療手段，因此，尋找高效、低毒的胃癌治療藥物具有重要意義。雷公藤紅素(celastrol)又稱南蛇藤素，是一種具有多種生物活性的醌甲基三萜類天然產(chǎn)物，來源于中藥雷公藤的根皮，具有抗炎、止痛、抗氧化、抗腫瘤等活性，臨床上廣泛用于風(fēng)濕疾病的治療[4-5]。近年來有學(xué)者[6-9]將雷公藤紅素用于抗腫瘤研究。本研究觀察了不同濃度雷公藤紅素對人胃癌HGC-27細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響，探究其抗腫瘤作用機(jī)制，為胃癌的藥物治療提供新的依據(jù)與解決方案。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國康寧公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，DPBS購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自德國PAN公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自納川公司，雷公藤紅素購自鴻汲康潤生物醫(yī)藥公司， 抗Bcl-2、Bax、Caspase3抗體購自萬類生物公司，抗ERK、磷酸化-ERK (p-ERK)、P38與磷酸化-P38(p-P38)抗體購自Abcam公司，內(nèi)參β-actin、GAPDH購自CST公司，AnnexinV-FITC/PI檢測試劑盒購自萬類生物公司。酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，蛋白電泳儀與凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系HGC-27(未分化)由錦州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室王秋寧老師贈予，用完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，100 U/mL青鏈霉素和100 mg/L鏈霉素)于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化，2～3 d傳代一次，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用于實(shí)驗。

1.3雷公藤紅素作用后HGC-27增殖比率的測定

將對數(shù)生長期的細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，7×103個/孔，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 μmol/L的雷公藤紅素培養(yǎng)0、24、48、72 h。在對應(yīng)的時間點(diǎn)采用MTT法測定細(xì)胞增殖比率。加入MTT(5 g/L)20 μL/孔，避光培養(yǎng)4 h后，吸取培養(yǎng)孔內(nèi)的液體，加入200 μL DMSO，酶標(biāo)儀振蕩10 min,在490 nm波長下檢測吸光度。每個濃度每個時間點(diǎn)設(shè)置3個復(fù)孔。增殖比率=實(shí)驗組吸光度/相應(yīng)0 h組吸光度。

1.4雷公藤紅素作用后HGC-27遷移率的測定采用劃痕實(shí)驗。取對數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，以3×106個/孔接種在6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪滿，用20 μL移液器吸頭進(jìn)行劃痕，PBS洗去劃下的細(xì)胞，加入含不同濃度(0.0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，鏡下拍照，通過測量劃痕寬度，計算遷移率。遷移率=(0 h劃痕寬度-其他時間點(diǎn)劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。每組3個復(fù)孔。

1.5雷公藤紅素作用后HGC-27凋亡率的檢測取對數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞，接種在6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度(0.0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素的培養(yǎng)基處理48 h，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，加500 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后，加10 μL PI混勻，同時設(shè)置兩個單陽管，室溫避光5～15 min后上流式細(xì)胞儀檢測。每組3個復(fù)孔。

1.6雷公藤紅素作用后HGC-27中核凋亡小體的檢測采用Hoechst32258染色法。取對數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度(0.0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素的培養(yǎng)基處理48 h，吸去培養(yǎng)基，加入Hoechst32258染色液覆蓋細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，用PBS洗2次，進(jìn)行熒光檢測。每組3個復(fù)孔。

1.7雷公藤紅素作用后HGC-27中相關(guān)蛋白的檢測采用Western blot法檢測Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、P38、ERK及p-P38、p-ERK的表達(dá)。收集不同濃度(0.0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素刺激48 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用預(yù)冷的PBS洗3次，加細(xì)胞裂解液，冰上振蕩30 min使細(xì)胞裂解完全，于4 ℃下14 000g離心5 min，取上清，BCA法測蛋白濃度。制作100 g/L SDS-PAGE膠，按照30 μg上樣量電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，BSA室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗5 min×3次，二抗室溫孵育2 h后，用TBST洗5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，對條帶進(jìn)行顯影拍照，以目的條帶與內(nèi)參條帶的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。每組3個復(fù)孔。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。HGC-27細(xì)胞增殖比率的比較采用7×3析因設(shè)計的方差分析，HGC-27遷移率、早期凋亡率、相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同濃度雷公藤紅素作用后HGC-27增殖比率的比較MTT法檢測結(jié)果(表1)表明，雷公藤紅素對HGC-27增殖有抑制作用，且呈劑量和時間依賴性。

2.2 4組HGC-27細(xì)胞遷移率的比較劃痕實(shí)驗結(jié)果(表2、圖1)顯示，1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素組細(xì)胞遷移率明顯下降(P<0.05)。

2.3 4組HGC-27細(xì)胞凋亡率的比較流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(表2)顯示，雷公藤紅素可促進(jìn)HGC-27細(xì)胞的早期凋亡。

表1 各組HGC-27增殖比率的比較(n=3)

F時間=729.864，F(xiàn)濃度=1 295.496，F(xiàn)交互=208.758，P<0.001

表2 4組HGC-27細(xì)胞遷移率和早期凋亡率的比較

*:與0.0 μmol/L組比較，P<0.05；#：與0.5 μmol/L組比較，P<0.05

圖1 劃痕實(shí)驗(×100)

2.4 4組HGC-27細(xì)胞核凋亡小體檢測結(jié)果Hoechst32258染色結(jié)果(圖2)顯示：與0.0 μmol/L組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L組HGC-27細(xì)胞核染色增強(qiáng)，熒光明亮，細(xì)胞核出現(xiàn)邊集化，出現(xiàn)明顯核固縮，細(xì)胞呈團(tuán)塊狀，表現(xiàn)出了凋亡特征；并且隨著作用濃度的升高，表現(xiàn)更加明顯。

圖2 4組細(xì)胞核凋亡小體的形成(Hoechst32258染色，×200)

2.5 4組HGC-27細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的比較Western blot檢測結(jié)果(圖3和表3、4)表明，雷公藤紅素可促進(jìn)HGC-27細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3、p-P38的表達(dá)，降低Bcl-2和p-ERK的表達(dá)。

1：0.0 μmol/L組；2：0.5 μmol/L組；3：1.0 μmol/L組；4：1.5 μmol/L組圖3 4組HGC-27細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3 4組HCG-27細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

*：與0.0 μmol/L組比較，P<0.05；#：與0.5 μmol/L組比較，P<0.05；△：與1.0 μmol/L組比較，P<0.05

表4 4組HCG-27細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

*：與0.0 μmol/L組比較，P<0.05；#：與0.5 μmol/L組比較，P<0.05；△：與1.0 μmol/L組比較，P<0.05

3 討論

蛋白質(zhì)的合成和降解在維持細(xì)胞狀態(tài)的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞內(nèi)大部分的蛋白質(zhì)都是由蛋白酶體降解的，蛋白酶體的靶蛋白在腫瘤的形成中起到關(guān)鍵作用[10]，如周期蛋白、腫瘤抑制蛋白、促腫瘤生長蛋白等。雷公藤紅素是一種蛋白酶體抑制劑，其可以通過抑制熱休克蛋白90(Hsp90)和蛋白酶體[11]，也可以通過抑制NF-κB信號通路[12]、PI3K/AKT/mTOR通路[12-13]和MAPK通路[[11]，發(fā)揮抗腫瘤作用。有文獻(xiàn)[6-9]報道其可以抑制前列腺癌、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長。Yu等[14]的課題組發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移。

本研究初步探索了雷公藤紅素對胃癌HGC-27細(xì)胞的抑制作用及其可能的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，雷公藤紅素可抑制HGC-27細(xì)胞的增殖，并且該抑制作用隨作用濃度的升高和作用時間的延長而逐漸增強(qiáng)；雷公藤紅素可誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞凋亡，降低HGC-27細(xì)胞的遷移能力，與文獻(xiàn)[13-15]報道相符。進(jìn)一步的實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素作用后HGC-27細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯升高，而Bcl-2則表達(dá)降低；侵襲相關(guān)蛋白p-P38表達(dá)升高，而p-ERK則表達(dá)降低。Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)相關(guān)，Bcl-2/Bax比例失調(diào)可促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[7，16]，兩者通過蛋白酶體途徑降解。Caspase-3在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起重要作用，并且是PARP分解的主要因素，Cleaved-PARP不能完成DNA修復(fù)和調(diào)節(jié)，可激活細(xì)胞凋亡機(jī)制中的細(xì)胞內(nèi)信號[17-18]。Cleaved Caspase-3是凋亡效應(yīng)產(chǎn)物。雷公藤紅素作為一種蛋白酶體抑制劑，可能通過抑制蛋白酶體的降解而促進(jìn)Bax的表達(dá)，從而使得Bcl-2/Bax比例失調(diào)，通過細(xì)胞內(nèi)凋亡機(jī)制誘導(dǎo)了HGC-27細(xì)胞的凋亡。ERK、P38是MAPK通路中的重要組成成分。本實(shí)驗中p-ERK、p-P38表達(dá)量的變化提示MAPK信號通路參與了雷公藤紅素誘導(dǎo)的胃癌HGC-27細(xì)胞遷移能力的降低。

總之，本研究結(jié)果表明，雷公藤紅素可能通過MAPK信號通路抑制了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移并誘導(dǎo)凋亡，這為其用于胃癌的治療提供了實(shí)驗依據(jù)，而雷公藤紅素具體的抗癌機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。

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