四種人子宮內膜癌細胞系中IGFBP-rP1的定位及表達

雷冬梅，趙晨陽，郭瑞霞，雷 佳，楚天驕，林艷麗

1)鄭州大學第三附屬醫院病理科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052

子宮內膜癌是女性生殖系統的三大惡性腫瘤之一，其發生發展是多因素參與的復雜過程。探討細胞因子在此過程中的作用對于子宮內膜癌的防治有積極的意義。胰島素樣生長因子結合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins，IGFBP)是胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)系統的重要組成部分，包括15個家族成員，其中傳統的IGFBP1～6主要通過調控IGF的半衰期發揮生物學效能。胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1(IGFBP-rP1)即IGFBP7，有別于傳統的IGFBP1～6，與IGF的結合力較低，但可與胰島素高度結合[1]。而且IGFBP-rP1可以不依賴于IGF而獨立發揮生物學活性，被認為是一種典型的腫瘤生長抑制因子，在多種腫瘤中發揮抑制作用[2-5]。目前IGFBP-rP1與子宮內膜癌的關系尚未明確，本實驗通過檢測不同子宮內膜癌細胞系中IGFBP-rP1的表達情況，為后續研究IGFBP-rP1在子宮內膜癌中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料人子宮內膜癌細胞系HEC-lA、Ishikawa由河南省醫藥科學研究院實驗室保存，RL95-2、HEC-1B購自中科院細胞庫，RPMI 1640培養基、DMEM培養基、DMEM/F12培養基購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗人IGFBP-rP1多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人GAPDH多克隆抗體購自杭州賢至生物科技有限公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購自鼎國生物技術有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，TRIzol試劑購自康為世紀生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司。

1.2細胞培養HEC-1A和HEC-1B細胞置于含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，Ishikawa及RL95-2細胞分別置于含體積分數10%胎牛血清的RMPI 1640、DMEM/F12培養基中，在37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養。每天觀察細胞生長狀況，每2～3 d進行消化傳代。

1.3細胞免疫熒光法檢測4種子宮內膜癌細胞中IGFBP-rP1蛋白的表達部位在6孔板中放置蓋玻片，將對數生長期的Ishikawa、HEC-lA、HEC-1B細胞用胰蛋白酶消化后，接種于其上面，24 h后取出爬片。由于RL95-2細胞系爬片困難，采用滴片法接種于玻片上。均用40 g/L的多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次。Triton-X100室溫通透15 min，PBS洗滌3次，山羊血清封閉30 min，滴加兔抗人IGFBP-rP1一抗(按1150稀釋)，4 ℃孵育過夜。滴加對應的熒光二抗，避光孵育30 min， DAPI染核，并在熒光顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗，所有實驗均在相同條件下進行。

1.4熒光定量PCR檢測4種子宮內膜癌細胞中IGFBP-rP1mRNA的表達收集對數生長期的4種子宮內膜癌細胞，Trizol法提取細胞總RNA。按反轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄成cDNA，以此為模板進行熒光定量檢測。IGFBP-rP1引物序列：上游5’-CAGGTGTACTTGAGCTGTGAGG-3’，下游5’-CATGTAAGGCATCAACCACTGT-3’；β-actin 引物序列：上游 5’-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3’，下游5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTC-3’。采用20 μL反應體系，SYBR?Green Realtime PCR混合物10 μL，已稀釋的cDNA 2 μL，上游及下游引物各0.8 μL，DEPC水補足。預變性：95 ℃ 60 s，1個循環；PCR 反應： 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環。采用 2-ΔΔCt法計算IGFBP-rP1 mRNA的表達水平。實驗均重復3次。

1.5Westernblot檢測4種子宮內膜癌細胞中IGFBP-rP1蛋白的表達對數生長期的子宮內膜癌細胞經胰蛋白酶消化后，提取細胞總蛋白并測定蛋白質濃度。100 g/L SDS-PAGE電泳后，200 mA 1 h濕轉至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉液常溫封閉1 h，滴加兔抗人IGFBP-rP1一抗(按1800稀釋)，兔抗人GAPDH(按11 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(按110 000稀釋)，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，將增強化學發光(ECL)試劑液均勻滴到膜上，曝光并顯影，用Image J軟件進行灰度分析。以目的蛋白條帶與GAPDH 條帶灰度值比值作為IGFBP-rP1蛋白的相對表達量。實驗重復3 次。

1.6統計學處理采用SPSS 20.0進行分析。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較4種子宮內膜癌細胞中IGFBP-rP1 mRNA與蛋白表達水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1IGFBP-rP1在4種人子宮內膜癌細胞系中的定位見圖1。IGFBP-rP1在4種子宮內膜癌細胞中均有表達，免疫熒光染色顯示IGFBP-rP1主要定位于子宮內膜癌細胞的胞質中。

2.2 4種人子宮內膜癌細胞中IGFBP-rP1mRNA和蛋白的表達見表1、圖2。 Ishikawa、RL95-2細胞中IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達水平高于HEC-1A、HEC-1-B細胞(P<0.05)；HEC-1A細胞中IGFBP-rP1 mRNA和蛋白的相對表達量最低(P<0.05)。

A：Ishikawa細胞；B：HEC-1A細胞；C：HEC-1B細胞；D：RL95-2細胞;1:目的蛋白；2：DAPI；3：Merge圖1 IGFBP-rP1在4種人子宮內膜癌細胞系中的表達(×400)

表1 4種子宮內膜癌細胞中IGFBP-rP1 mRNA與蛋白表達量的比較

*：各組間兩兩比較，P均<0.05

圖2 4種子宮內膜癌細胞系中IGFBP-rP1蛋白的表達

3 討論

IGFBP-rP1主要在肝臟合成，在多種組織、器官如腎臟、肝臟、卵巢中均有表達[6]，其在調控細胞的增殖、分化、凋亡、血管生成等代謝過程中發揮極為重要的作用[7]。有研究[8-9]報道，不同惡性腫瘤中IGFBP-rP1的作用方式有所不同，其在多種腫瘤如肝細胞癌、胃癌等組織中表達下調，發揮腫瘤抑制因子的作用，然而在極少數腫瘤如膠質瘤中表達上調。另有研究[10]發現，結腸癌組織中IGFBP-rP1高表達，然而在8種結腸癌細胞系中，IGFBP-rP1僅表達于SW480、Caco2細胞，其他結腸癌細胞系中其表達缺失。實體腫瘤及細胞系中IGFBP-rP1表達的異質性及作用不同，提示多種信號系統參與了其調節，然而有關IGFBP-rP1的基因調控及其與細胞因子關系的研究較少。子宮內膜癌的發生主要與子宮內膜受雌激素長期刺激以及體內雌、孕激素失衡有關。本研究選取不同雌激素受體α(ERα)表達狀態的4種子宮內膜癌細胞系，其中Ishikawa、RL95-2細胞ERα陽性表達，HEC-1B、HEC-1A細胞ERα陰性表達。細胞免疫熒光染色顯示4種子宮內膜癌細胞系中均存在IGFBP-rP1的表達。IGFBP-rP1 mRNA及蛋白檢測提示，不同子宮內膜癌細胞系中IGFBP-rP1均有表達，且在高分化Ishikawa細胞中的表達高于中分化的其他3種細胞，提示其表達可能與分化程度有關。實驗結果顯示，不同ER狀態的子宮內膜癌細胞系中, IGFBP-rP1 的表達有所差異，IGFBP-rP1在ERα陽性細胞系Ishikawa、RL95-2中的表達相對較高，在ERα陰性細胞系HEC-1A、HEC-1B中的表達相對較低。研究[11]發現， IGFBP-rP1在多種ERα陽性的乳腺癌細胞系及部分ERα陰性乳腺癌細胞系中表達缺失，而在少數ERα陰性乳腺癌細胞系中仍有表達；這與本研究結果并不完全一致，推測可能與不同腫瘤細胞的生物學性狀差異有關。ERα是一種核受體，雌激素與ERα結合后通過調節下游靶基因的轉錄發揮作用[12]。研究[13]發現，接近生理劑量的雌激素可能通過ER途徑使滋養層細胞中IGFBP-rP1的表達上調。而在子宮內膜癌中， IGFBP-rP1的表達是否受到雌激素的調節仍待進一步研究，這也為研究IGFBP-rP1與子宮內膜癌的關系提供新的思路。

研究[14]表明PTEN是一種抑癌基因，其在子宮內膜癌組織中的突變率明顯高于正常子宮內膜，其突變及缺失參與了子宮內膜癌的發生。4種子宮內膜癌細胞系中，HEC-1A為野生型PTEN細胞系，未發生PTEN基因突變，Ishikawa、RL95-2為突變型PTEN細胞系，伴有PTEN的突變或缺失。本研究結果顯示，IGFBP-rP1在HEC-1A細胞中的表達低于Ishikawa、RL95-2細胞。研究[15]發現，將結腸癌細胞與成纖維細胞共培養，成纖維細胞中IGFBP-rP1的高表達與TGF-β及經典Wnt信號通路有關。有學者[16]發現皮膚黑色素瘤中IGFBP-rP1的表達與BRAFV600E基因的突變存在相關性。

綜上所述，本研究結果表明IGFBP-rP1的表達可能與PTEN基因有關，而IGFBP-rP1與PTEN之間的關系需要更為深入的研究。本研究初步篩選出相對高表達與低表達的子宮內膜癌細胞系，為進一步研究IGFBP-rP1在子宮內膜癌中的作用機制提供了理論依據。

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