NOX4在BEAS-2B細胞上皮間質轉化過程中的作用

薛 騰，赫 欣，任亞南，張 愷，闕菡雅，姚 武，周 舫

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 450001 2)漯河醫學高等專科學校預防醫學教研室 河南漯河 462000 3)鄭州市疾病預防控制中心 鄭州 450000

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一類嚴重的慢性炎癥進行性疾病，主要臨床特征為氣道對外界刺激高反應導致呼吸持續性受阻，主要病理特征為氣道和支氣管上皮組織發生纖維化而出現氣道重塑的現象[1-2]。吸煙、大氣污染物中可吸入性顆粒物以及工作環境中的粉塵，均是COPD發病的有害因素[3]。在氣道重塑過程中，上皮組織會發生大面積的纖維化，纖維化過程中一個重要的生物學過程是上皮細胞發生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[4]。上皮細胞發生EMT后，上皮細胞標志如E-cadherin蛋白逐漸丟失，同時間質細胞標志如Vimentin表達逐漸升高[5]。非吞噬細胞氧化酶4(non-phagocytic oxidase 4,NOX4)的主要功能是產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS可以介導細胞的多種生物學過程，比如增殖、遷移、分化等，并且與EMT進程密切相關[6-7]。轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)是一種多功能細胞因子，可以調節細胞的生長、分化等生物學過程，同時可以誘導EMT過程[8-9]。二苯基氯化碘(diphenyliodonium iodide, DPI)可以和NOX家族蛋白的C端和N端特異性結合，進而抑制NOX家族蛋白的表達[10]。本研究中我們用TGF-β刺激人正常肺上皮細胞BEAS-2B以構建EMT細胞模型，然后用DPI特異性抑制NOX4的表達，觀察NOX4表達變化是否影響EMT過程，為COPD患者的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料BEAS-2B細胞由新鄉醫學院吳衛東教授饋贈。TGF-β(美國Peprotech公司)，羊抗鼠IgG二抗、NOX4一抗、Vimentin一抗(美國Santa Cruz公司)，E-cadherin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，胎牛血清(美國Gemini公司)，含雙抗RPMI 1640培養基(北京索萊寶公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，ROS檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。CO2培養箱(上海力康生物醫療科技控股有限公司)，DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)，ECLIPSE TS100-F倒置顯微鏡(上海Heal Force公司)，Sunrise remote酶標儀(奧地利TECAN公司)，Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2細胞培養用含體積分數10%胎牛血清且含雙抗的RPMI 1640培養基復蘇、傳代、培養BEAS-2B細胞，培養條件為：37 ℃，CO2體積分數為5%，相對濕度為95%。

1.3TGF-β刺激對BEAS-2B細胞EMT相關蛋白表達的影響待BEAS-2B細胞鋪滿培養瓶的80%～90%時，選取生長狀況較好的細胞做饑餓處理。用0.0、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/L的TGF-β刺激細胞24 h后，收集細胞，用含PMSF的裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。將各組蛋白濃度調整一致，按比例加入4×loading buffer后，95 ℃水浴5 min變性。隨后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件：濃縮膠恒壓80 V，電流強度50～70 mA，分離膠恒壓120 V。轉膜條件：恒流290 mA，根據目標蛋白的相對分子質量調整轉膜時間。PVDF膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉，分別用E-cadherin、Vimentin一抗(200 μg/L)孵育，羊抗鼠二抗(100 μg/L)孵育。最后進行ECL顯影，經Quantity One定量分析，選定后續實驗TGF-β的濃度。實驗均重復3次。

1.4細胞分組取對數生長期的BEAS-2B細胞，分為4組。空白對照組：只加入RPMI 1640培養基；TGF-β組：用含有5 μg/L TGF-β的RPMI 1640培養基培養細胞；DPI組：用含有0.5 μg/L DPI的RPMI 1640培養基培養細胞；TGF-β+DPI組：用同時含有5 μg/L TGF-β和0.5 μg/L DPI的RPMI 1640培養基培養細胞。培養24 h后，收集細胞，以備后續檢測。

1.5 4組細胞NOX4、E-cadherin、Vimentin蛋白表達的檢測同1.3中方法檢測4組細胞3種蛋白的表達。實驗重復3次。

1.6 4組細胞ROS水平的檢測取以上各組細胞，利用熒光探針DCFH-DA檢測ROS，用流式細胞儀，488 nm激發光激發，FL1-h收集DCF的熒光信號，用信號強度代表細胞內ROS水平。實驗重復3次。

1.7 4組細胞遷移能力檢測取BEAS-2B細胞接種于6孔板，待細胞長至90%時，用200 μL的無菌槍頭在孔板中間做一條劃痕，PBS清洗后，按1.4分組處理24 h，用倒置顯微鏡拍照、觀察，用Photoshop進行寬度分析。劃痕寬度為分組處理24 h后劃痕寬度與處理前劃痕寬度的比值，比值越大，遷移能力越低。實驗重復3次。

1.8統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較不同質量濃度的TGF-β處理后細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用2×2析因設計的方差分析探討TGF-β和DPI對BEAS-2B細胞NOX4、E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平，ROS水平及遷移能力的影響，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1TGF-β刺激對BEAS-2B細胞EMT相關蛋白的影響結果見圖1、表1。 由表1可以看出，與0.0 μg/L組相比，5.0 μg/L組E-cadherin表達降低，Vimentin表達升高。TGF-β為10.0 μg/L和5.0 μg/L時，上述2指標差異無統計學意義，因此后續實驗中選取TGF-β的質量濃度為5.0 μg/L。

1～5：分別為0.0、1.0、2.5、5.0和10.0 μg/L TGF-β刺激圖1 不同質量濃度TGF-β刺激后EMT蛋白變化

表1 不同質量濃度TGF-β刺激后BEAS-2B細胞中EMT相關蛋白的表達

*：與0.0 μg/L組相比，P<0.05；#：與1.0 μg/L組相比，P<0.05；△：與2.5 μg/L組相比，P<0.05。

2.2 4組細胞NOX4、EMT相關蛋白表達水平、ROS水平和劃痕寬度比較由圖2、表2可知，TGF-β可以增加NOX4、Vimentin、ROS的表達，降低E-cadherin的表達以及劃痕寬度；DPI可以抑制NOX4、Vimentin、ROS的表達，增加E-cadherin的表達以及劃痕寬度；DPI可拮抗TGF-β對NOX4、E-cadherin、ROS的作用。

1:空白對照組；2:TGF-β組；3:TGF-β+DPI組；4:DPI組圖2 4組NOX4及EMT相關蛋白的表達

表2 4組BEAS-2B細胞相關指標的比較(n=3)

3 討論

根據世界衛生組織發布的數據可以看出，COPD居全球死因的第4位，并且預測在2030年，COPD將升至第3位死因。誘發COPD的因素有很多，如吸煙、大氣污染，特別是大氣污染物中可吸入性顆粒物PM2.5等[11]。COPD患者往往會發生氣道重塑，此時支氣管上皮細胞會發生EMT進程[12]。在EMT進程中，細胞內的NOX1/4表達升高，同時ROS產量增加[13]。鑒于NOX4和EMT進程有著密切的聯系，我們設計以下實驗觀察NOX4在BEAS-2B細胞EMT進程中的作用。

我們首先用不同質量濃度的TGF-β刺激BEAS-2B細胞，發現5 μg/L刺激24 h，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達降低，間質細胞標志蛋白Vimentin表達上升，說明5 μg/L的TGF-β刺激24 h可以構建BEAS-2B細胞EMT模型。接下來，我們用DPI抑制TGF-β刺激的BEAS-2B細胞NOX4的表達，觀察其對EMT進程的影響。結果顯示，在TGF-β誘導BEAS-2B細胞EMT進程時，NOX4表達升高，ROS產量增加，E-cadherin蛋白表達降低。和TGF-β組相比，TGF-β+DPI組NOX4表達降低，E-cadherin蛋白表達有所回升，ROS水平降低。有研究[14]表明，ROS可以作為細胞內的第二信使，促進Smad、Snail等轉錄因子的表達，進而促進EMT進程。本研究結果同樣顯示，NOX4被抑制后，ROS產量降低，ROS降低后，不足以維持BEAS-2B細胞的EMT進程，因此EMT進程被中斷。劃痕實驗結果顯示，TGF-β誘導的BEAS-2B細胞遷移能力增強，DPI抑制NOX4后，和TGF-β組相比，TGF-β+DPI組細胞的遷移能力有所降低。經歷EMT進程后，細胞骨架會發生重建，細胞失去極性，細胞間的連接能力降低，一些促進遷移的蛋白如MMP-1、MMP-9的表達升高，進而促進了細胞的遷移[15-16]。而在本實驗中，我們用DPI抑制NOX4的表達，進而BEAS-2B細胞的EMT進程被抑制，最終降低了細胞的遷移能力。

綜上所述，抑制NOX4的表達可以降低ROS的產量，進而抑制TGF-β誘導的BEAS-2B細胞EMT進程，最終降低細胞的遷移能力。EMT進程在COPD的發生發展中起著至關重要的作用，研究EMT進程的機制將為COPD的治療提供新的理論基礎。

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