自噬對MCF-7細胞紫杉醇化療敏感性的影響

石 瑛，路 璐，王云鳳，任靜靜，賈莉婷，常愛民，馬 丹，魏園玉

1)鄭州大學第三附屬醫院檢驗科 鄭州 450052 2)鄭州大學檢驗系 鄭州 450052

紫杉醇是治療乳腺癌的一線化療藥物[1-2]，但部分患者對紫杉醇耐藥。研究[3]發現，紫杉醇在發揮其藥效時，不僅可誘導乳腺癌細胞凋亡，還可通過PI3K/Vps34途徑抑制自噬。自噬是公認的細胞對抗不良生長環境的一種重要保護機制。正常細胞受缺血、缺氧等刺激后，自噬可將細胞內受損細胞器或變性蛋白質降解并提供能量供細胞再利用，有利于細胞的生長與恢復[4]。在腫瘤治療過程中，腫瘤細胞正是利用了自噬對細胞的保護作用，抵抗化療藥物對腫瘤細胞的損傷作用，阻礙化療藥物誘導的細胞凋亡；自噬效應可降低腫瘤細胞對藥物的敏感性而導致耐藥[5-7]。陳莎等[8]研究發現，抑制自噬可增強三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞和MDA-MB-468細胞對紫杉醇的敏感性。本研究以乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，探討利用自噬抑制劑3-MA抑制自噬是否可以提高MCF-7細胞對紫杉醇的敏感性，從而為乳腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料MCF-7細胞購自美國ATCC細胞庫。胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司，RPMI 1640不完全培養基購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗人p62單克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人LC3B(包含LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ)單克隆抗體購自美國CST公司，兔抗人GAPDH多克隆抗體和羊抗兔IgG-HRP購自生工生物工程(上海)有限公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，細胞增殖毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自日本同仁化學研究所，紫杉醇購自西安昊軒生物科技有限公司，3-MA購自美國Selleck公司。

1.2細胞培養MCF-7細胞培養于含體積分數10%滅活FBS的RPMI 1640完全培養基中，并置于37 ℃、體積分數 5% CO2培養箱中培養，待細胞融合度達到80%～90% 時進行傳代或用于后續實驗。

1.3紫杉醇作用濃度的篩選取對數生長期的MCF-7細胞，按8×103個/孔接種到96孔板，待細胞融合度達80%～90%時，用不同濃度紫杉醇[終濃度分別為0.0(對照)、7.8、15.6、31.2、125.0、500.0和1 000.0 nmol/L]處理24 h。棄掉原培養基，加入100 μL不完全培養基及10 μL CCK-8溶液，繼續培養1 h后使用酶標儀測定450 nm處的OD值并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。每組設4個平行孔，共進行3次實驗。通過繪制標準曲線計算紫杉醇的IC30值。

1.4紫杉醇作用時間的篩選用IC30濃度的紫杉醇分別處理MCF-7細胞0、6、12、24 h后，用RIPA細胞裂解液裂解各組細胞，提取總蛋白，每組取20 μg蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液以體積比41混勻，煮沸變性。用120 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后將分離的蛋白轉到0.22 μm PVDF膜，放入含有50 g/L脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1 h后，分別加入稀釋后的兔抗人LC3B單克隆抗體和兔抗人GAPDH多克隆抗體(均按11 000稀釋)，4 ℃過夜；次日TBST洗滌PVDF膜，加入羊抗兔IgG-HRP(按110 000稀釋)，室溫孵育1 h；TBST再次洗膜后采用高靈敏度化學發光顯色。采用Image J軟件分析條帶灰度值。目的蛋白的相對表達量以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示。每組設置3個平行孔，共進行3次實驗。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡情況取MCF-7細胞，分為空白組、紫杉醇組(IC30紫杉醇處理細胞24 h)、3-MA組(5 mmol/L 3-MA處理細胞24 h)和3-MA+紫杉醇組(5 mmol/L 3-MA預處理細胞2 h后IC30紫杉醇處理細胞24 h)。收集各組細胞，用預冷的0.01 mol/L PBS洗滌1～2次后，加入100 μL Binding buffer制成1×106mL-1細胞懸液。加入5 μL FITC標記的磷脂結合蛋白Annexin V和5 μL碘化丙啶輕輕混勻，室溫避光孵育15～30 min。最后，加入400 μL Binding buffer重懸細胞，30 min內上機檢測。細胞獲取與數據分析由BD FACSDiva.8軟件進行。細胞凋亡率以早期凋亡率和晚期凋亡率的總和進行計算。每組設置3個平行孔，共進行3次實驗。

1.6Westernblot法檢測細胞中自噬相關蛋白表達情況按照1.5分組處理MCF-7細胞后，按1.4中Western blot方法檢測LC3B和p62蛋白的表達，其中一抗兔抗人單克隆抗體按11 000稀釋。

1.7CCK-8法檢測細胞增殖情況另取對數生長期的MCF-7細胞，按8×103個/孔接種到96孔板，待細胞融合度達80%～90%時，首先用5 mmol/L 3-MA預處理2 h，然后加入終濃度為IC30的紫杉醇處理24 h；或者僅用紫杉醇處理MCF-7細胞24 h。最后按照1.3中方法檢測并計算增殖抑制率。

1.8統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較紫杉醇處理不同時間MCF-7細胞LC3B蛋白的表達，采用2×2析因設計方差分析比較紫杉醇和3-MA對MCF-7細胞IC3B蛋白和p62蛋白表達的影響，采用兩獨立樣本t檢驗比較紫杉醇聯合3-MA對細胞增殖的影響。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1紫杉醇作用濃度的篩選7.8、15.6、31.2、125.0、500.0、1 000.0 nmol/L紫杉醇處理24 h對MCF-7細胞的增殖抑制率分別為(5.9±1.8)%、(13.5±0.7)%、(27.9±2.1)%、(37.7±1.3)%、(44.6±1.0)%、(67.4±1.4)%，通過繪制標準曲線計算紫杉醇的IC30為31.2 nmol/L，將此濃度用于后續實驗。

2.2紫杉醇作用時間的篩選Western blot結果見圖1。31.2 nmol/L紫杉醇處理0、6、12和24 h， MCF-7細胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值分別為：(1.39±0.22)、(0.99±0.09)、(0.71±0.09)和(0.50±0.36)，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值隨紫杉醇作用時間的延長有降低的趨勢(F=31.080,P<0.001)，因此選用24 h作為紫杉醇處理MCF-7細胞的時間。

2.3 4組細胞凋亡率及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62表達水平的比較Western blot結果見圖2和表1。結果顯示，紫杉醇或3-MA單用均可促進MCF-7細胞凋亡，降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值，升高p62蛋白水平，并且二者聯用具有協同作用。

圖1 紫杉醇作用不同時間MCF-7細胞中LC3B蛋白的表達

圖2 4組MCF-7細胞自噬相關蛋白的表達

表1 4組MCF-7細胞凋亡率及自噬相關蛋白表達的比較

2.4 3-MA與紫杉醇聯用對MCF-7細胞增殖的影響自噬抑制劑3-MA預處理后，IC30的紫杉醇對MCF-7細胞的增殖抑制率較單用紫杉醇升高[(42.3±2.2)%vs(29.2±4.3)%，t=4.670,P=0.010]。

3 討論

紫杉醇自1965年問世以來，一直是治療各種癌癥的一線抗癌藥物，但是隨著用藥時間的延長，癌細胞對紫杉醇的敏感性逐漸降低，因此，提高紫杉醇對腫瘤細胞的敏感性逐漸受到重視。

自噬是細胞抵御不良環境的一種自我保護機制，將衰老或受損的蛋白質、細胞器及其他細胞成分運送到溶酶體進行降解和再循環而保護細胞，維護細胞穩態[9-11]。自噬的完成需要多種自噬相關因子參與，其中LC3B和p62是自噬形成與發生的重要標志物，通常用于判定是否可以形成一個完整的自噬流。LC3B分為LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ兩種形式，當自噬上調時，LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ轉化，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值增高。p62在自噬溶酶體形成過程中可被降解，所以其表達降低說明自噬溶酶體形成，自噬上調。隨著對自噬研究的深入，發現自噬不僅與腫瘤的發生、發展有關[12-13]，還與腫瘤細胞耐藥密切相關[14-15]。

Veldhoen等[3]發現紫杉醇在乳腺癌細胞中通過PI3K/Vps34途徑抑制自噬的發生，進而減弱了腫瘤細胞對藥物損傷的抵抗作用，因此抑制腫瘤細胞內的自噬有可能成為改善化療療效和放療敏感性的新策略。本研究結果顯示，紫杉醇可以抑制MCF-7細胞增殖，且對細胞內自噬水平具有抑制作用，因此自噬可能參與了紫杉醇發揮殺傷效應的過程。進一步的研究發現與單用紫杉醇相比，自噬抑制劑3-MA與紫杉醇聯合應用后，MCF-7細胞增殖抑制率和凋亡率均進一步升高，細胞內LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低，p62表達增高，說明3-MA可有效協助紫杉醇抑制自噬。以上結果表明，抑制自噬可增強MCF-7細胞對紫杉醇的敏感性。臨床研究[16]也表明，使用自噬抑制劑氯喹或羥氯喹與化療藥物聯合治療乳腺癌等惡性腫瘤已經取得階段性成果。

綜上所述，自噬與MCF-7細胞對紫杉醇的敏感性密切相關，深入研究自噬影響MCF-7細胞對紫杉醇敏感性的機制，將有助于臨床有效解決乳腺癌耐藥的問題，并且本研究也為紫杉醇聯合自噬抑制劑治療乳腺癌提供了實驗依據。在今后的研究中，我們還需進一步探索自噬影響MCF-7細胞對紫杉醇敏感性的具體機制，同時通過動物實驗更深入證明自噬在紫杉醇耐藥中的作用。

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