運動預處理對大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護作用

路富林，余 琦，魏 明

1)西安醫學院體育部 西安 710021 2)西安醫學院基礎醫學部 西安 710021

心血管疾病是目前世界范圍內導致死亡的重要原因。心臟發生缺血后，及時有效地恢復血液供應仍是最佳的治療手段，而再灌注早期會導致心肌損傷進一步加重，形成再灌注損傷[1]。心肌缺血再灌注損傷的機制研究[2]主要集中在鈣超載、氧化應激、炎癥反應和能量代謝障礙等。有研究表明，適宜的運動對機體有保護作用，可以增強心肌功能，減少冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發生率和病死率[3]，并可減少缺血再灌注引起的心肌損傷[4]，但具體機制仍不清楚。Sirtuin(簡稱Sirt)是高度保守的家族，由7個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸組成[5]，即Sirt1～7，Sirt1是位于細胞核內的一種去乙酰化酶，具有重要的轉錄調控因子作用，可調節基因轉錄、腫瘤發生、氧化應激和炎癥反應等過程[6]。本研究采用運動預處理干預大鼠心肌缺血再灌注過程，通過心肌梗死面積、心肌纖維形態變化、細胞凋亡相關蛋白和Sirt1及其底物FOXO1蛋白表達的變化，觀察運動預處理是否可以減輕缺血再灌注引起的心肌損傷，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 成年健康雄性SD大鼠40只，體重(220±20) g，購于第四軍醫大學實驗動物中心，自由攝食、飲水。室溫控制在25 ℃，通風良好，自然光照，控制濕度。

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：LDH試劑盒購自美國R&D公司，cTnI試劑盒、SOD活性檢測試劑盒以及MDA含量檢測試劑盒均購自南京建成生物試劑公司，Cleaved Caspase-3和Cytochrome C抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Sirt1和Ac-FOXO1抗體購自美國Santa Cruz公司。主要儀器：小動物跑臺購自北京中西遠大科技有限公司，型號M9W-315587；Centrifuge 5804R低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司；EPS600電泳儀購自上海天能科技有限公司。

1.2動物分組及運動方式40只大鼠適應性喂養1周后采用隨機數字表法分為對照組(n=10)、運動預處理組(n=10)、缺血再灌注組(n=10)和運動預處理+缺血再灌注組(n=10)。對照組和缺血再灌注組不進行運動訓練，運動預處理組和運動預處理+缺血再灌注組進行跑臺運動，依據Bedford標準制定中等強度的運動方式：跑臺坡度為+5°、速度為15 m/min，每天持續30 min，每周訓練6 d，為期6周。

1.3在體缺血再灌注模型的制備大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，切開氣管行氣管插管，連接小動物呼吸機(潮氣量25 mL/kg，頻率70次/min)，心電圖監測心率。于左心耳下距主動脈根部約2 mm處，用帶線縫合針(5-0)穿過約2 mm寬的心肌束(含有冠狀動脈左前降支)，在心肌束和結扎線之間放一硅膠管，將線結扎于硅膠管上，造成局部缺血，30 min后松開結扎線，抽出硅膠管恢復冠狀動脈左前降支灌注2 h。其中對照組和運動預處理組只開胸、穿線但不結扎。實驗中以結扎冠狀動脈左前降支后心電圖ST段抬高作為結扎成功的標志。

1.4血清中cTnI和LDH含量的檢測實驗結束后，采集各組大鼠血清，嚴格按照cTnI和LDH檢測試劑盒說明書操作，依次加入各反應液，測定各組大鼠血清中cTnI和LDH的含量。

1.5心肌組織形態學觀察實驗結束后，各組大鼠均快速打開胸腔，暴露心臟，并立即剪下心臟，用PBS溶液沖洗，每組心臟取心尖部左心室組織，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，行常規脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后觀察心肌組織形態學的變化。

1.6心肌線粒體SOD和MDA的檢測實驗結束后，各組稱取40 mg心尖部左心室組織，放入盛有PBS的1.5 mL EP管中并在冰上剪碎，用PBS溶液反復清洗干凈，4 ℃ 1 000g離心1 min，棄上清，然后加入300 μL線粒體分離試劑，冰上勻漿20 min，4 ℃ 3 000g離心5 min，上清移至另一EP管中，4 ℃ 16 000g離心30 min，沉淀即為線粒體。嚴格按照線粒體MDA和SOD檢測試劑盒說明書操作，檢測MDA含量和SOD活性。

1.7心肌組織中Sirt1、Ac-FOXO1、CleavedCaspase-3和CytochromeC表達的檢測采用Western blot法。稱取各組相同重量的心尖部左心室組織，常規方法提取蛋白，BCA比色法進行蛋白定量，蛋白樣品與5×Loading Buffer混勻后在沸水中煮7 min。配制SDS-PAGE分離膠，每孔蛋白上樣量為35 μg，濃縮膠和分離膠分別以80 V和120 V恒壓電泳，采用濕轉方式，以90 V恒壓轉膜70 min，將蛋白轉至PVDF膜。用50 g/L脫脂牛奶室溫下封閉90 min，然后將目的條帶切下，分別用Sirt1(11 000稀釋)、Ac-FOXO1(11 000稀釋)、Cleaved Caspase-3(11 000稀釋)、Cytochrome C(11 000稀釋)以及內參GAPDH(15 000稀釋)的抗體4 ℃孵育過夜。用Image J 圖像分析軟件分析各組條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.8統計學處理采用SPSS 22.0進行數據分析。不同組間血清中LDH和cTnI含量，心肌線粒體中MDA含量和SOD活性，心肌組織中Cleaved Caspase-3、Cytochrome C、Sirt1、Ac-FOXO1蛋白相對表達量的比較均采用2×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠心肌形態結構的比較HE染色結果見圖1。可知，對照組心肌纖維結構清晰、完整，排列整齊，纖維間有分支連接形成網狀結構；細胞核位于纖維中，多核，呈藍色。運動預處理組心肌纖維結構和形態與對照組相似。缺血再灌注組心肌纖維結構紊亂，斷裂明顯，纖維束及其邊界消失，心肌纖維間出現大量空洞，細胞核逸出。運動預處理+缺血再灌注組心肌纖維排列明顯改善，纖維斷裂減少，少量纖維邊界模糊，纖維間縫隙變大。

A：對照組；B：運動預處理組；C：缺血再灌注組；D：運動預處理+缺血再灌注組圖1 各組大鼠左心室心肌組織HE染色結果(×400)

2.2各組大鼠血清中LDH和cTnI含量的比較結果見表1。

表1 各組大鼠血清中cTnI和LDH含量的比較

2.3各組大鼠心肌組織中CytochromeC和CleavedCaspase-3蛋白表達的變化結果見圖2、表2。

1：對照組；2：運動預處理組；3：缺血再灌注組；4：運動預處理+缺血再灌注組圖2 各組大鼠心肌組織中Cytochrome C和Cleaved Caspase-3的表達

表2 各組大鼠心肌組織中Cleaved Caspase-3和Cytochrome C表達的比較

2.4各組大鼠心肌組織中Sirt1和Ac-FOXO1表達的變化結果見圖3、表3。

1：對照組；2：運動預處理組；3：缺血再灌注組；4：運動預處理+缺血再灌注組圖3 各組大鼠心肌組織中Sirt1和Ac-FOXO1的表達

表3 各組大鼠心肌組織中Sirt1和Ac-FOXO1表達的比較

2.5各組大鼠心肌線粒體SOD活性和MDA含量的變化結果見表4。

表4 各組大鼠心肌線粒體MDA含量和SOD活性的比較

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死溶栓治療、冠狀動脈成形術、心臟外科體外循環等過程中不可避免的病理變化。心肌缺血預處理可以產生具有心肌保護作用的內源性物質，從而減少術后心律不齊的發生，提高心肌存活率。有研究[7-8]證明，運動預處理可以產生類似于缺血預處理的心肌保護作用。運動預處理是指運動訓練可以增強心臟對缺血再灌注刺激的耐受性，其心肌保護效應可能是兩方面的作用：其一是由于運動可以誘發機體產生內源性的保護因子；其二是運動本身導致心肌出現缺血或相對缺血的現象從而引起缺血預處理的結果。但參與運動預處理心肌保護作用的細胞內信號分子仍不明確，其具體機制還不清楚。

運動會導致機體的耗氧量增加，氧供相對不足，一方面會使細胞內產生過多的氧自由基，從而引起細胞產生氧化損傷；另一方面，為了減輕機體的氧化應激損傷，多種信號通路可通過誘導抗氧化酶的產生，提高心肌清除氧自由基的能力。這種預處理方式有利于增強心臟的抗氧化能力，使其耐受缺血缺氧等傷害性刺激引起的損傷。本研究觀察了運動預處理對正常大鼠的影響，結果發現，血清中LDH、cTnI含量以及心肌線粒體MDA含量、SOD活性無變化。這些結果說明，運動本身對心臟并沒有造成損傷。

本研究采用在體缺血再灌注模型，觀察到缺血再灌注組大鼠血清中cTnI和LDH的含量明顯增加，凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3和Cytochrome C的表達明顯上調，表明缺血再灌注組心肌損傷加重；而運動預處理可降低缺血再灌注引起的血清中cTnI和LDH含量的增加，下調Cleaved Caspase-3和Cytochrome C的表達。以上結果說明，運動預處理可以減輕缺血再灌注引起的心肌損傷。Sirt1廣泛存在于哺乳動物組織細胞的胞漿和胞核內，通過對組蛋白和非組蛋白的去乙酰化，參與代謝、能量調節和許多生理過程，如細胞增殖、分化、衰老和凋亡等[9]。有文獻[10]報道，Sirt1在神經退行性疾病、心血管疾病、代謝性疾病和慢性腎病等疾病中均發揮保護作用。另有文獻報道，Sirt1在氧化應激時表達上調[11-12]，而且可通過增加FOXO3和FOXO4活性來減少心肌細胞氧化應激損傷[13-14]。本研究發現，缺血再灌注組心肌Sirt1蛋白表達下調，其底物FOXO1乙酰化水平增加，而運動預處理可明顯上調Sirt1的表達，降低FOXO1的乙酰化。同時，運動預處理可明顯改善缺血再灌注引起的線粒體SOD活性降低，減少線粒體內MDA的含量，說明運動預處理可降低缺血再灌注引起的氧化應激。

綜上所述，本研究結果顯示運動預處理可通過增加線粒體內SOD活性，減少MDA含量，降低細胞凋亡相關蛋白的表達，從而改善缺血再灌注引起的氧化應激損傷，這可能與Sirt1和FOXO1信號通路有關，但具體機制仍有待進一步研究。

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