Septin2在胃癌組織中的表達(dá)及對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李君君，方 磊，高 陽，時(shí) 帥，何昊宇，劉曉梅，袁彩君

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 遼寧錦州 121000

胃癌是世界癌癥死亡的第二大常見原因。Septin基因家族是一類具有GTPase活性的保守基因家族,參與細(xì)胞質(zhì)分裂、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等重要生理過程[1-5]，與多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[6-9]。Septin可保護(hù)原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2免于泛素化并胞吞和溶酶體降解，有助于癌細(xì)胞質(zhì)膜上受體的穩(wěn)定。有文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道Septin2在胃癌組織中的表達(dá)升高，并與胃癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)方法分析胃癌組織和正常組織之間Septin2 mRNA的表達(dá)差異，通過免疫組化染色驗(yàn)證其在蛋白水平的表達(dá)差異，通過進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確Septin2表達(dá)變化對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討其成為監(jiān)測(cè)胃癌發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)記物的可能性，為胃癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1胃癌和正常組織中Septin2mRNA的表達(dá)差異和在線生存分析從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)中下載GSE54129數(shù)據(jù)集中的胃組織Septin2 mRNA表達(dá)譜，共132例，其中正常組織21例，癌組織111例；利用GEO2R分析工具分析對(duì)比胃癌組織和正常組織中Septin2 mRNA的表達(dá)差異。利用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)數(shù)據(jù)庫中的胃癌數(shù)據(jù)進(jìn)行在線生存分析；共631例，隨訪時(shí)間150個(gè)月，在隨訪期內(nèi)死亡為終點(diǎn)事件；以Septin2 mRNA表達(dá)水平中位數(shù)為界分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，分別繪制兩組的生存曲線。

1.2胃癌組織中Septin2蛋白的檢測(cè)采用免疫組化染色法。收集2016年錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃癌術(shù)后患者的病理蠟塊共141例，其中胃正常組織23例，不典型增生組織2例，高、中、低分化腺癌組織7、50、57例，胃腸間質(zhì)瘤組織2例。切片厚度4 μm，經(jīng)脫苯脫蠟水化抗原修復(fù)等步驟后，將兔抗人Septin2抗體(稀釋度1100)滴片，室溫孵育2 h，PBS洗片后加入羊抗兔二抗(稀釋度1500)室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精染核，透明封片。抗體購自美國Abcam公司。由病理科2位專家共同閱片。200倍顯微鏡下選擇3個(gè)視野觀察。按染色程度進(jìn)行評(píng)分，未染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，深黃色計(jì)3分；按染色區(qū)域百分比進(jìn)行評(píng)分，0%～計(jì)0分，5%～計(jì)1分，25%～計(jì)2分，50%～計(jì)3分，75%～100%計(jì)4分；兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為最終評(píng)分。該實(shí)驗(yàn)獲得錦州醫(yī)科大學(xué)及其附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3轉(zhuǎn)染Septin2對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

1.3.1 Septin2對(duì)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MNK-45購買于沈陽百思生物科技有限公司。將SGC-7901和MNK-45用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(美國Gibco公司)、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，并按常規(guī)方法傳代、凍存和復(fù)蘇。將SGC-7901和MNK-45接種到6孔板，待細(xì)胞匯合至70%～80%，使用Lipofectamine3000(美國賽默飛世爾科技公司)將Septin2表達(dá)質(zhì)粒(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，按說明書操作，37 ℃孵育細(xì)胞2 d， G418篩選，挑選單克隆細(xì)胞株2株進(jìn)行傳代培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染Septin2表達(dá)質(zhì)粒的2株細(xì)胞分別為轉(zhuǎn)染1組和轉(zhuǎn)染2組。

1.3.2 細(xì)胞中Septin2 mRNA的檢測(cè) 采用Real-time PCR法檢測(cè)。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再根據(jù)SYBR染料試劑盒說明進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，試劑盒及SYBR熒光染料均購自大連寶生物(TaKaRa)公司。Septin2上游引物序列：5’-AGCGCTCGAGCGCCACCATGTCTCGATTCTACGATG TCTAAGC-3’，下游：5’-AGCGAGAATTCTTACACGTG GTGCCCGAGAG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CAAT GACCCCTTCATTGACC-3’，下游：5’-TGGAAGATGGT GATGGGATT-3’。PCR擴(kuò)增體系：SYBR染料10 μL，模板cDNA 2 μL，DEPC水6 μL，上、下游引物(100 μmol/L)各1 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火34 s，72 ℃延伸 34 s(59次循環(huán))，65 ℃終延伸5 s，0.5 ℃結(jié)束。根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞中Septin2 蛋白的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)。收集細(xì)胞，按蛋白提取試劑盒說明提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白并定量。以100 g/L SDS-PAGE凝膠在110 V下進(jìn)行蛋白分離電泳，然后在60 V下將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗(兔抗人Septin2抗體，稀釋度1400；兔抗人GAPDH抗體，稀釋度1500)4 ℃孵育過夜，次日加二抗(羊抗兔抗體，稀釋度11 000)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。全蛋白提取試劑盒、超敏和化學(xué)發(fā)光試劑盒、兔抗人Septin2抗體購自Abcam公司，兔抗人GAPDH抗體購自沈陽萬類生物公司。

1.3.4 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自沈陽萬類生物公司。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，接種于96孔板，2×103個(gè)/孔，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，分別于細(xì)胞完全貼壁24、48、72 h后取出細(xì)胞，按MTT 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒提示操作，最后于490 nm處檢測(cè)培養(yǎng)孔光密度，表示細(xì)胞增殖能力。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 凋亡檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基公司。收集細(xì)胞并用PBS沖洗2次，加入500 μL的1×Annexin V緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V試劑后，于37 ℃避光孵育15 min，然后每管加入5 μL PI標(biāo)記的Annexin V試劑，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用Flow Jo軟件分析細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。胃癌組織和正常組織中Septin2 mRNA在線數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)，Septin2蛋白陽性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)；4組胃癌細(xì)胞Septin2蛋白、mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較，細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1胃癌和正常組織中Septin2mRNA表達(dá)差異和在線生存分析結(jié)果GSE54129數(shù)據(jù)集中，胃正常組織和癌組織中Septin2 mRNA表達(dá)量分別為(6.42±0.25)、(8.70±0.43)，胃癌組織中Septin2 mRNA表達(dá)高于正常組織(t=23.511，P<0.001)。Septin2 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組生存曲線見圖1，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間短于低表達(dá)組。

A:低表達(dá)組；B高表達(dá)組圖1 Septin2 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存曲線

A～F:胃正常組織、不典型增生、高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、胃腸間質(zhì)瘤圖2 不同胃組織中Septin2蛋白的表達(dá)(免疫組化染色，×200)

2.3轉(zhuǎn)染Septin2的胃癌細(xì)胞中Septin2的表達(dá)SGC-7901和MNK-45轉(zhuǎn)染Septin2表達(dá)質(zhì)粒后，Septin2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，見圖3、表1、表2。

1～4：SGC-7901細(xì)胞陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染1組、轉(zhuǎn)染2組；5～8：MNK-45細(xì)胞陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染1組、轉(zhuǎn)染2組圖3 胃癌細(xì)胞Septin2蛋白的表達(dá)

表1 4組SGC-7901細(xì)胞中Septin2 mRNA和蛋白表達(dá)的比較

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

表2 4組MNK-45細(xì)胞中Septin2 mRNA和蛋白表達(dá)的比較

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

2.4轉(zhuǎn)染Septin2的胃癌細(xì)胞增殖能力的變化SGC-7901和MNK-45細(xì)胞轉(zhuǎn)染Septin2表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，見表3、表4。

2.5轉(zhuǎn)染Septin2的胃癌細(xì)胞凋亡能力的變化SGC-7901和MNK-45細(xì)胞轉(zhuǎn)染Septin2表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞凋亡受抑，見表5。

表3 4組SGC-7901細(xì)胞增殖能力的比較

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

表4 4組MNK-45細(xì)胞增殖能力的比較

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

表5 4組細(xì)胞凋亡率的比較 %

*：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

3 討論

Septin基因家族是一類具有GTPase活性的保守基因家族,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少13個(gè)家族成員,編碼13個(gè)Septins (SEPT1～12, SEPT14)，家族成員之間具有很高的同源性，僅N端和C端稍有不同，位于其中央的GTP結(jié)合位點(diǎn)具有GTP酶活性，是最為保守的核心結(jié)構(gòu)域[12]。研究[13]表明Septin蛋白是繼微管蛋白、F-actin和中間纖維蛋白之后的第4種細(xì)胞骨架成分，并在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期調(diào)控與凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用。Septin基因功能改變與霍奇金淋巴瘤、膽管細(xì)胞癌、乳腺癌、髓樣白血病等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1,6-8]。Septin對(duì)脫落的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜突起的形成至關(guān)重要，因此其可能在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為中發(fā)揮重要作用[9]。作為Septin基因家族的重要癌癥相關(guān)成員，Septin9已被證實(shí)與卵巢腫瘤、頭頸部腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道的發(fā)生關(guān)系密切[9]。有臨床試驗(yàn)[14-15]證實(shí)血漿中甲基化Septin9可作為結(jié)直腸癌機(jī)會(huì)性篩查的指標(biāo)。Septin6在淋巴組織中廣泛表達(dá)，且表達(dá)水平較高，其表達(dá)下調(diào)與嬰幼兒急性髓系白血病發(fā)生有關(guān)，被認(rèn)為是混合性系統(tǒng)白血病的一種融合伴侶[16]。

Septin2是一種GTP結(jié)合骨架蛋白，其基因位于2號(hào)染色體上，可通過與其他Septin蛋白形成核心復(fù)合體來發(fā)揮相應(yīng)的功能。目前有關(guān)Septin2與腫瘤關(guān)系的研究較少。Septin2在腦腫瘤中的表達(dá)水平呈細(xì)胞周期依賴性，在G2/M期腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平最高；阻斷星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Septin2的表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)分裂進(jìn)程受阻，形成多核巨細(xì)胞[17]。有報(bào)道[18]抑制肝癌細(xì)胞中Septin2的表達(dá)，可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡。此外，有文獻(xiàn)[19]報(bào)道乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移活動(dòng)需要通過Septin2基因激活MEK/ERK通路來實(shí)現(xiàn)。

目前，胃癌已是世界癌癥死亡的第二大常見原因，將近60%的胃癌患者手術(shù)時(shí)已發(fā)生局部轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，明確胃癌發(fā)病機(jī)制以及尋求新的治療靶點(diǎn)尤為重要。近年來，生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展為發(fā)現(xiàn)癌癥特征基因提供了新的思路。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)Septin2與胃癌的發(fā)生及預(yù)后有關(guān)；進(jìn)一步的免疫組化和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確了Septin2是與胃癌發(fā)生相關(guān)的癌基因，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡。Septin2有可能成為篩查、監(jiān)測(cè)胃癌發(fā)生及判斷預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)記物，也可能成為胃癌靶向治療的新靶點(diǎn)，但其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步的探索。

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